WSTĘP

Ostra białaczka limfoblastyczna (ALL – acute lymphoblastic leukemia) jest najczęstszym typem białaczki wieku dziecięcego (1), stanowi blisko 30% nowotworów u dzieci (2). Jest niejednorodną jednostką chorobową, wykazującą indywidualne dla każdego pacjenta cechy morfologiczne, immunofenotypowe oraz genetyczne. W oparciu o wspomniane specyficzne cechy stworzono szereg klasyfikacji (cytomorfologiczną, fenotypową oraz cytogenetyczną), których celem jest określenie odpowiedniej grupy ryzyka oraz odpowiedniej strategii leczenia (3).

W ostatnich latach w związku z postępem w diagnostyce i leczeniu ostrych białaczek całkowitą remisję udaje się uzyskać u 95% pacjentów (4). Pomimo intensywnego leczenia w dalszym ciągu u 20-30% dzieci dochodzi do wznowy choroby (5, 6, 7). Nawroty ostrej białaczki są nadal poważnym problemem, a wyniki leczenia, łącznie z przeszczepem szpiku wciąż nie są zadowalające (6, 7). Pomimo znacznego postępu wiedzy śmiertelność w nawrocie ostrej białaczki limfoblastycznej wynosi odpowiednio 75,5% w przypadku ostrej białaczki prekursorowej limfocytów B (BCP-ALL) oraz 95% w przypadku białaczki T-komórkowej (T-ALL) (8). Czynnikami w znacznym stopniu pogarszającymi rokowanie są między innymi czas trwania remisji krótszy niż rok, wysoka wyjściowa wartość leukocytów, młodszy wiek, niektóre aberracje genetyczne (chromosom Ph czy rearanżacja 11q23) a także T-ALL (6).

Wieloparametryczna cytometria przepływowa jest rutynową metodą diagnostyczną, wnoszącą do rozpoznania ostrej białaczki limfoblastycznej wiele ważnych informacji (precyzyjne określenie immunofenotypu komórek białaczkowych, lekooporności, podejrzenie niektórych aberracji chromosomalnych itp.) (9).

Wiele uwagi poświęca się znaczeniu monitorowania minimalnej choroby resztkowej (MRD – minimal residual disease) w kolejnych punktach czasowych. Uznanymi metodami diagnostycznymi pozwalającymi na wykrywanie MRD są cytometria przepływowa, a także metody molekularne oparte na wykrywaniu komórek o nieprawidłowym genotypie z wykorzystaniem reakcji PCR (wykrywanie genów fuzyjnych oraz rearanżacji genów immunoglobulin i receptorów limfocytów T) (7).

Dzięki dokładnej ilościowej ocenie resztkowych komórek białaczkowych w określonych punktach czasowych, możliwe będzie bardzo precyzyjne określenie grup prognostycznych (pod względem ryzyka wznowy), a co za tym idzie poprawa klasyfikacji ostrych białaczek oraz indywidualizacja leczenia (4, 7, 9, 10, 11).

Skuteczność wykrywania choroby resztkowej metodą cytometrii przepływowej zależy między innymi od stabilności immunofenotypu komórek białaczkowych. Zmiany immunofenotypu blastów mogą w znacznym stopniu utrudniać cytometryczną analizę choroby resztkowej, co może być jedną z przyczyn fałszywie ujemnych wyników w trakcie jej monitorowania.

CEL PRACY

Celem badania było porównanie immunofenotypu blastów przy rozpoznaniu oraz przy wznowie w ostrej białaczce limfoblastycznej u dzieci oraz określenie najczęściej występujących zmian w ekspresji antygenów komórkowych.

MATERIAŁ I METODY

Retrospektywnej analizie poddano 14 pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną, hospitalizowanych na Oddziałach Onkologii Dzieci Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Zabrzu i Katowicach w latach 2000-2007, u których doszło do wznowy choroby (u 12 rozpoznano białaczkę prekursorową z limfocytów B – BCP-ALL, natomiast 2 przypadki dotyczyły białaczki z komórek T – T-ALL). Pacjenci leczeni byli zgodnie z międzynarodowymi programami leczniczymi BFM 1990 dla SRG, ALLIC-BFM 2002. Spośród 14 pacjentów z nawrotem choroby u 11 pacjentów rozwinęła się wznowa szpikowa, u 3 zdiagnozowano izolowaną wznowę oponową.

Potwierdzenie diagnozy oraz wznowy choroby oparte było na badaniu cytomorfologicznym oraz immunofenotypowym szpiku kostnego oraz płynu mózgowo-rdzeniowego.

Dokładny immunofenotyp komórek białaczkowych przy rozpoznaniu oraz wznowie został określony z użyciem wieloparametrycznej cytometrii przepływowej. Do oceny i analizy fenotypów wykorzystano techniki cytometrii 3-kolorowej (przy użyciu cytometru przepływowego marki BD FACScan) oraz 6-kolorowej (BD FACSCanto).

W skład 3-kolorowego panelu diagnostycznego wchodziły następujące kombinacje przeciwciał monoklonalnych: CD34-FITC/ CD45-PE/ CD19-PerCP/TdT-FITC/CD10-PE/ CD20-FITC/ CD22-PE/CD38-PE/CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP/ CD7-FITC/CD5-PE/ CD2-FITC/CD1a-PE/ HLA-DR-FITC/CD13-PE/CD14-FITC/CD117-PE/CD15-FITC/CD33-PE/MPO-FITC. Natomiast w przypadku panelu 6-kolorowego wykorzystano: CD34-FITC lub APC-Cy7 lub PE/ CD45-FITC lub PerCP/ CD19-APC lub PE lub PE-Cy7/ TdT-FITC/ CD10-PE-Cy7/ CD20-APC-Cy7/CD22-APC/CD38-APC/CD58-FITC/CD15-FITC/NG7,1-PE/CD4-PE-Cy7/CD8-APC-Cy7/CD3-PerCP/CD5-PE.

Wyniki analizowano przy użyciu programów komputerowych Paint-a-gate, DIVA oraz Infinicyt. Ekspresja poszczególnych markerów wynosząca poniżej 30% oceniana była jako negatywna, pomiędzy 30-40% jako pośrednia (dim), natomiast powyżej 50% jako pozytywna.

WYNIKI

W badanej grupie pacjentów znaczące zmiany w ekspresji poszczególnych markerów zaobserwowano u 12/14 (86%) pacjentów. Zmiany występowały w obydwu grupach pacjentów BCP-ALL oraz T-ALL. W przypadku BCP-ALL zmiany obecne były w 10/12 przypadkach (co stanowi 83%) oraz u 2 badanych pacjentów z T-ALL (100%). Dokładne określenie immunofenotypu komórek białaczkowych w momencie rozpoznania i wznowy zostało przedstawione w tabeli I (pacjenci z BCP-ALL) oraz w tabeli II (pacjenci z T-ALL). Spośród markerów liniowo niespecyficznych antygen CD34 okazał się być najbardziej niestabilny, zmiany w jego ekspresji obecne były u 57% pacjentów zarówno z BCP jak i T-ALL. Na uwagę zasługuje fakt, iż zmiany w jego ekspresji były dość znaczące – w 6 przypadkach sygnał uległ całkowitej zmianie z pozytywnego na negatywny. Wśród markerów charakterystycznych dla linii B komórkowej największa częstość zmian w ekspresji skojarzona była z markerami CD20 ( zmiany obserwowano w 41,5% przypadków) oraz CD22 (27%). W przypadku antygenu CD22 u 2 pacjentów zaobserwowano całkowitą zmianę intensywności ekspresji z pozytywnej na negatywną. Zmiany w ekspresji antygenu CD20 nie były tak znaczące – najczęściej z pozytywnej na pośrednią.

Spośród markerów specyficznych dla linii limfocyta T największą zmiennością cechowały się antygeny CD3, CD4 oraz CD8. Z kolei najbardziej stabilnymi markerami w grupie pacjentów z BCP-ALL były antygeny CD19 i CD10, natomiast w grupie chorych na T-ALL antygeny CD1a, CD2, CD5, CD7. Markery HLA-DR, TdT oraz CD45 pozostały względnie stałe zarówno w jednej jak i drugiej grupie pacjentów.

Przykładowe porównanie immunofenotypu komórek białaczkowych przedstawiono na rycinie 1.

DYSKUSJA

Niniejsza praca potwierdza fakt, iż zmiany immunofenotypu blastów są stosunkowo częstym zjawiskiem. Różnice pomiędzy fenotypem komórek białaczkowych, obecne u 91,7% pacjentów, mogły być jedną z przyczyn fałszywie ujemnych wyników w ocenie minimalnej choroby resztkowej. Tłumaczy to między innymi zjawisko występowania wznów u pacjentów z negatywnym wynikiem badania w kierunku choroby resztkowej.

Dane zawarte w piśmiennictwie (tab. III) z ostatnich dwóch dekad również potwierdzają fakt występowania zmian w immunofenotypie komórek białaczkowych pomiędzy rozpoznaniem oraz wznową w ostrej białaczce limfoblastycznej (12, 13, 14, 15). Rodzaje antygenów ulegających zmianie, jak i tych stabilnych były wspólne w większości opublikowanych badań (CD34, CD20, CD22 – markery niestabilne, CD19, HLA-DR, TdT – markery stabilne). Większa częstość zmian immunofenotypu w aktualnej publikacji w porównaniu z poprzednimi pracami, spowodowana była prawdopodobnie różnicą w liczebności badanych grup pacjentów, co w przyszłości powinno zostać skorygowane w miarę powiększania się grupy badawczej.

Van Wering oraz współpracownicy w pracy z wykorzystaniem szerokiego panelu przeciwciał zaobserwowali zmiany immunofenotypowe u 69% chorych na BCP-ALL oraz u 63% chorych na T-ALL. W grupie BCP-ALL zmiany w ekspresji dotyczyły takich markerów komórkowych jak CD34, którego ekspresja zmieniła się u 23% badanych, TdT – odpowiednio 13%, CD10 – 16%, CD20-16%, CD22 – 19%. Zmianę w ekspresji antygenu CD19 zaobserwowano u 9% pacjentów. Z kolei zmiany występowały najrzadziej w przypadku antygenu HLA-DR. Stwierdzono także zmiany w ekspresji antygenów CD9, CD24 oraz CyIgu. Z kolei w grupie T-ALL najczęstsze zmiany związane były z antygenami CD34 (którego zmienność obecna była w 29% przypadków), CD2 (50%), CD4 (38%). Antygen HLA-DR również w tej grupie okazał się być najbardziej stabilny, podobnie jak antygeny CyCD3, SmCD3 oraz TCRαβ czy γδ, w przypadku których nie stwierdzono żadnych zmian w ekspresji (12).

Guglielmi i wsp. zmiany fenotypu komórek białaczkowych opisali u 38% chorych z BCP-ALL oraz u 80% z T-ALL. Różnice pomiędzy fenotypem przy rozpoznaniu i wznowie występowały powszechnie oraz były związane zarówno z pojawieniem się czy utratą określonych antygenów. Najczęstsze zmiany skojarzone były z następującymi markerami komórkowymi CD10, CD20, cyIgM, CD13, CD33 (BCP-ALL) oraz CD3 (T-ALL). W 26,5% przypadków zmiany w ekspresji antygenów komórkowych doprowadziły do zmiany klasyfikacji choroby. Autorzy zwrócili uwagę, iż na skutek zmian fenotypu, powstały duże trudności w interpretacji badania w kierunku choroby resztkowej metodą cytometrii przepływowej, co mogło doprowadzić do wyników fałszywie ujemnych w ocenie MRD (13).

Ching-Hon Pui w pracy z 1986 roku, w której zajmował się zmianami w ekspresji czterech antygenów komórek nowotworowych CD10 (CALLA), TdT, HLA-DR oraz T10, również zauważył dużą częstość zmian fenotypowych. Utrata CD10, najczęściej zmieniającego się antygenu w badanej grupie, w razie nawrotu interpretowana była jako czynnik niekorzystny rokowniczo. Zmiany ekspresji – chociaż nie tak częste jak w przypadku CD10, obecne były także w przypadku antygenów TdT oraz HLA-DR. Z kolei marker T10 uległ zmianie nie tylko w przypadku białaczki T- komórkowej, dla której jest specyficzny ale także w przypadku białaczki prekursorowej limfocytów B (14).

Badanie Borowitza i współpracowników, przeprowadzone na licznej grupie pacjentów z BCP-ALL, również wskazało istotny wpływ zmian immunofenotypowych blastów na skuteczność monitorowania minimalnej choroby resztkowej. Różnice w ekspresji poszczególnych markerów komórkowych, obecne u 69% badanych pacjentów najczęściej dotyczyły antygenów CD34, CD20 oraz CD45. Najbardziej stabilnym markerem z linii limfocyta B był CD19 (15).

WNIOSKI

Uzyskane wyniki wskazują na potrzebę zastosowania podczas monitorowania MRD metodą cytometrii przepływowej, co najmniej dwóch różnych kombinacji antygenów (lub co najmniej pięciu antygenów równocześnie), aby zwiększyć skuteczność monitorowania minimalnej choroby resztkowej poprzez wyeliminowanie ryzyka wyników fałszywie ujemnych.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Szczepański T., van der Velden V.H.J, van Dongen J.J.M.: Flow-cytometric immunophenotyping of normal and malignant lymphocytes. Clin. Chem. Lab. Med., 2006, 44, 775-796.

2.    Perek D.: Choroby nowotworowe. w: Kubicka K., Kawalec W. Podręcznik Pediatrii. PZWL, Warszawa, 2006.

3.    Kebriaei P., Anastasi J., Larson R.A.: Acute lymphoblastic leukemia: diagnosis and classification. Best Practice and Research Clinical Haematology, 2003, 15, 597-621.

4.    Izraeli, Waldman D.: Minimal residual dsease in childhood acute lymphoblastic leukemia: current status and challenges. Acta Haematol., 2004, 112, 34-39.

5.    Chessels J.M, Veys P., Kempski H., Henley P., Leiper A., Webb D.: Long-term follow-up after relapsed chidhood acute lymphoblastic leukemia. British Journal of Haematology, 2003, 13, 396-405.

6.    Chessells J.M.: Relapsed lymphoblastic leukaemia in children: a continuing challenge. Br. J. Haematol., 1998, 102, 423-438.

7.    Van Dongen J.J.M., Seriu T., Panzer-Grumayer E.R., Biondi A., Pongers-Willemse M.J., Corral L., Stolz F., Schrappe M., Masera G., Kamps W.A, Gadner H., Van Wering E.R, Ludwig W.D., Basso G., De Bruijn M.AC., Cazzaniga G., Hettinger K., Van der Does-van der Berg A., Hop W.C.J., Riehm H., Bartram C.R.: Prognostic value of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukaemia in childhood. The Lancet, 1998, 352, 1731-1738.

8.    Rivera G.K., Zhou Y., Hancock M.L., Gajjar A., Rubnitz J., Ribeiro R.C., Sandlund J.T., Hudson M., Relling M., Evans W.E, Pui C.: Bone marrow recurrence after initial intensive treatment for childhood acute lymphoblastic leukemia. Cancer, 2005, 103, 368-376.

9.    Van Lochem E.G., van der Velden V.H.J, Wind H.K, te Marvelde J.G., Westerdaal N.A.C., van Dongen J.J.M.: Immunophenotypic Differentiation Patterns of Normal Hematopoiesis in Human Bone Marrow: Reference Patterns for Age-Related Changes and Disease-Induced Shifts. Cytometry Part B (Clinical Cytometry), 2004, 60B, 1-13.

10.    Szczepański T.: Why and how to quantify minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia? Leukemia, 2007, 216, 622-626.

11    Karczmarek A., Osawa T., Leporowska E., Mackiewicz A.: The role of flow cytometry in clinical diagnosis. Współczesna Onkologia, 2002, 6, 366-373.

12.    Van Wering E.R., Beishuizen A., Roeffen E.T.J.M, Van der Linden-Schrever B.E.M., Verhoeven M.A.J., Hahlen K, Hooijkaas H., Van Dongen J.J.M:. Immunophenotypic changes between diagnosis and relapse in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia, 1995, 9, 1523-1533.

13.    Guglielmi C., Cordone I., Boecklin F., Masi S., Valentini T., Vegna M.L., Ferrari A., Testi A.M., Foa R.: Immunophenotype of adult and childhood acute lymphoblastic leukemia: changes at first relapse and clinico-prognostic implications. Leukemia, 1997, 11, 1501-1507.

14.    Pui B.C-H., Raimondi S.C., Behm F.G., Ochs J., Furman W.L., Bulin N.J., Ribeiro R.C., Tinsley P.A., Mirro J.: Shifts in blast cell phenotype and karyotype AT relapse of childhood lymphoblastic leukemia. Blood,1986, 68, 1306-1310.

15.    Borowitz M.J, Pullen D.J., Winick N., Martin P.L., Bowman W.P., Camitta B.: Comparison of diagnostic and relapse flow cytometry phenotypes in childhood acute lymphoblastic leukemia: implications for residual disease detection: A report from the Children’s Oncology Group Cytometry Part B, Clinical Cytometry, 2005, 68B, 18-24.

..............................................................................................................................................................

Adres do korespondencji:

Tomasz Szczepański
Katedra i Klinika Pediatrii,
Hematologii i Onkologii Dziecięcej
ul. 3 Maja 13/15, 41-800 Zabrze