*Praca finansowana z projektu: PBZ-KBN 122/P05/01-3 Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego

WSTĘP

Choroby kręgu Charcot-Marie-Tooth o dziedziczeniu autosomalnym recesywnym (AR-CMT) stanowią niezwykle trudny problem diagnostyczny. Jak dotąd nie opublikowano danych o częstości występowania AR-CMT w różnych populacjach i w zależności od kraju pochodzenia. Ma to ogromne znaczenie m.in. ze względu na różny odsetek małżeństw między krewnymi. Częstość występowania AR-CMT w populacjach izolowanych, jak również niektórych krajach basenu Morza Śródziemnego może wynosić do 50%, podczas gdy w populacjach europejskich, takich jak Polska, częstość form recesywnych szacuje się na 4-10% (1). Jak dotąd historia naturalna różnych form AR-CMT nie została dobrze poznana. Istniejące opisy kliniczne chorych ograniczają się do kilkudziesięciu przypadków. Zwiększająca się liczba publikacji zogniskowanych na podłożu molekularnym AR-CMT wraz z lakonicznymi opisami obrazu klinicznego CMT utrudnia dodatkowo analizę przypadków i stworzenie czytelnych korelacji genotypowo-fenotypowych.

Wyniki badań genetycznych ostatnich 10 lat ujawniły znaczną heterogenność genetyczną AR-CMT (14 loci, 12 genów). Dzięki wprowadzeniu badań molekularnych w AR-CMT możliwym stało się wyodrębnienie poszczególnych fenotypów (ryc. 1) (2, 3). Recesywny sposób dziedziczenia choroby opisywany jest ponadto w przypadku mutacji w genach odpowiedzialnych za neuropatie o dziedziczeniu dominującym wywołane mutacjami w takich genach jak: PMP22, MPZ czy Cx32 w przypadku których opisuje się zwykle mutacje w złożonej heterozygocie.

Przed erą badań molekularnych o rozpoznaniu AR-CMT decydował sposób dziedziczenia, który orzekano wyłącznie na podstawie analizy rodowodu, wczesnego początku choroby i zwykle ciężkiego przebiegu klinicznego.

Prototypem AR-CMT jest rodzeństwo opisane przez Dejerine’a i Sottasa w 1893 r. (4).

Brak cech charakterystycznych dla poszczególnych odmian AR-CMT oraz niejednolity przebieg choroby w obrębie nawet tego samego podtypu wraz ze skąpymi danymi klinicznymi, uniemożliwia ukierunkowanie badań genetycznych. Oznacza to, że w ujęciu diagnostyki molekularnej w przypadku podejrzenia neuropatii o recesywnym sposobie dziedziczenia, należałoby przeprowadzić sekwencjonowanie większości genów. Nawet przy bardzo rozwiniętym „warsztacie molekularnym” analiza 12 genów stanowi wciąż znaczną trudność. Analiza wielo-genowa dostarczać może ponadto wielu wyników (warianty sekwencji), których udział w patogenezie AR-CMT będzie trudny do udowodnienia. Wielu badaczy wskazuje ponadto na istnienie znacznie większej liczby genów, których mutacje mogą być zaangażowane w wystąpienie neuropatii AR-CMT, szczególnie w przypadku neuropatii o charakterze aksonalnym.

Jak dotąd najwięcej mutacji (33) w AR-CMT zidentyfikowano w genie GDAP1 kodującym białko o nazwie ganglioside-induced differentiation-associated protein 1 (5). Białko GDAP1 bierze udział w procesach związanych z utrzymaniem dynamiki sieci mitochondrialnej, promując jej rozpad (6).

Drugim co do częstości genem ulegającym mutacjom w AR-CMT jest gen kodujący periaksynę (PRX) (13). Jest to białko biorące udział w przekazywaniu sygnałów pomiędzy aksonem i osłonką mielinową (7, 8).

Dotychczas zidentyfikowano 12 mutacji w obrębie genu EGR2 (early growth response 2) w tym 3 związane z neuropatią o dziedziczeniu recesywnym. Gen EGR2 kodujący czynnik transkrypcyjny zaangażowany jest przede wszystkim w regulację transkrypcji genów związanych z procesem mielinizacji i odpowiedzialnych za prawidłowe funkcjonowanie komórki Schwanna (9, 10, 11).

Na osobne omówienie zasługuje gen CTDP1 kodujący białko o nazwie CTD (carboxy-terminal domain, RNA polymerase II, polypeptide A) phosphatase, subunit 1 isoform FCP1a, którego mutacje stwierdza się w bardzo rzadkiej formie neuropatii występującej wraz z wrodzoną zaćmą, niedosłuchem i dysmorfią twarzy – CCFDN (ang. congenital cataracts, facial dysmorphism, and neuropathy) (12, 13).

CEL PRACY

Celem pracy była analiza molekularna wybranych genów sprzężonych z chorobami kręgu Charcot-Marie-Tooth o dziedziczeniu autosomalnym recesywnym oraz próba stworzenia algorytmu diagnostyki molekularnej w populacji polskiej.

W pracy przedstawiono również trudności w interpretacji  wariantów sekwencyjnych (mutacja patogenna/polimorfizm) stwierdzonych w obrębie badanych genów.

MATERIAŁ I METODY

Materiał do badań stanowiło DNA pochodzące od 78 chorych i 60 zdrowych osób reprezentujących 62 rodziny z chorobą Charcot-Marie-Tooth. Wszystkie osoby których DNA zostało wykorzystane w pracy podpisały świadomą zgodę na badania. Na wykonanie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego.

W celu wytypowania rodzin z prawdopodobnym autosomalnym recesywnym sposobem dziedziczenia, zastosowano następujące kryteria:

– wczesny początek wystąpienia pierwszych objawów choroby,

– brak wykładników dominującego sposobu dziedziczenia (analiza rodowodów),

– recesywny charakter neuropatii (minimum dwoje chorych dzieci zdrowych rodziców lub spokrewnienie rodziców).

Grupę kontrolną stanowiły 52 próbki DNA pochodzące od zdrowych rodziców dzieci chorych na mukowiscydozę, zespół łamliwego chromosomu X oraz członków ich rodzin.

Genomowe DNA uzyskano z leukocytów metodą opartą na wysalaniu białek metodą Millera (14).

W celu wytypowania rodzin z prawdopodobnym autosomalnym recesywnym sposobem dziedziczenia należało w pierwszym rzędzie wykluczyć najczęściej występujące w CMT mutacje tj. duplikacje i delecje genu PMP22 w regionie 17p11.2-p12.

Badanie regionu 17p11.2-p12 polegało na analizie polimorfizmów fragmentów restrykcyjnych (PCR-RFLP) (15) oraz badaniu względnej ilości kopii RQ (relative quantification) genu PMP22 metodą PCR w czasie rzeczywistym (Real-Time PCR (16). Wartości referencyjne dla próbek DNA uzyskanych od osób zdrowych (2 kopie genu PMP22) wyznaczone w naszym laboratorium wynoszą od 0,700 do 1,090, wartości poniżej 0,600 oznaczają delecję natomiast wartości powyżej 1,180 odpowiadają duplikacji genu PMP22.

Sekwencje kodujące z granicznymi obszarami intronowymi czterech genów GDAP1, PRX, EGR2 oraz CTDP1 (około 6000 produktów reakcji PCR) analizowano dwoma metodami przesiewowymi: analizą polimorfizmów konformacji fragmentów jednoniciowych (SSCP) oraz analizą heterodupleksów (HA). W przypadku wystąpienia zmian wzoru migracji produktów PCR w analizach SSCP i/lub HA produkty PCR były sekwencjonowane. Analizę sekwencji badanych genów przeprowadzono przy pomocy programów komputerowych oraz baz danych dostępnych w Internecie.

W przypadku dwóch wariantów sekwencyjnych w genie GDAP1 (c.347C>T; Met116Thr) i PRX (c.1194_1197delTTCC; Ser399fsX410) wykonywano analizę funkcjonalną zmian metodami immunocytochemicznymi. Analizę mutacji c.347C>T w genie GDAP1 przeprowadzono in vitro w komórkach COS-7 transfekowanych odpowiednimi wektorami ekspresyjnymi pEGFP-C1 dla cDNA z mutacją oraz z allelem dzikim. Następnie komórki wybarwiano znacznikami mitochondrialnymi Mito Tracker Red CMXRos oraz Mito Tracker Orange CMTMRos i wykonywano immunobarwienie z przeciwciałem skierowanym przeciwko białku GDAP1 (17). Analizę mutacji w genie PRX przeprowadzano na skrawku mrożonym nerwu łydkowego pacjenta z użyciem immunobarwienia z przeciwciałami wykrywającymi N-koniec, C-koniec i region sekwencji powtórzeniowych L-periaksyny oraz przeciwciałami przeciw białku MBP (myelin basic protein) i MAG (myelin-associated glycoprotein) (18).

WYNIKI

Stosując metody analizy RFLP-PCR oraz Real-Time PCR w 8 rodzinach u 15 chorych stwierdzono duplikację regionu 17p11.2-p12 i genu PMP22. Liczba ta stanowi 12,9% ogółu badanych rodzin, podczas gdy procent duplikacji we wszystkich rodzinach z CMT opisywany na świecie oraz w rodzinach zgromadzonych w naszym banku DNA wynosi około 45%. U 10 chorych zidentyfikowano duplikację regionu 17p11.2-p12 metodą RFLP-PCR oraz metodą Real-Time PCR duplikację genu PMP22. U 5 chorych duplikację regionu 17p11.2-p12 wykonano stosując metodę Real-Time PCR. Czułość metody RFLP-PCR w grupie badanej wyniosła 67%. Nie zidentyfikowano wśród badanych delecji genu PMP22.

W wyniku analizy sekwencji kodujących oraz złączy ekson/intron genów: GDAP1, PRX, EGR2 oraz CTDP1 zidentyfikowano łącznie 30 wariantów sekwencyjnych. Siedem ze znalezionych mutacji uznanych zostało za patogenne (ryc. 2).

W genie GDAP1 wykryto 9 wariantów, w tym 5 patogennych w 4 rodzinach; w genie PRX – 15 wariantów, w tym 2 patogenne w dwóch rodzinach (jeden wariant w układzie homozygotycznym oraz drugi wariant w układzie heterozygotycznym u jednego chorego, u którego zidentyfikowano także duplikację genu PMP22). W przypadku mutacji patogennych w genie GDAP1 stwierdzono podobny fenotyp neuropatii rozpoczynających się we wczesnym dzieciństwie, charakteryzujących się ciężkim przebiegiem z wybitną przewagą uszkodzenia aksonalnego. Mutacja  Ser399fsX410 w genie PRX została wykryta u chłopca z ciężką neuropatią demielinizacyjną z wybitnie zaznaczonymi zaburzeniami czucia powierzchniowego i głębokiego.

W genach EGR2 oraz CTDP1 zidentyfikowano po trzy warianty sekwencyjne niepatogenne.

Zastosowana analiza bioinformatyczna wariantów sekwencji genów: GDAP1, PRX, EGR2 oraz CTDP1 potwierdziła patogenną rolę pięciu mutacji w genie GDAP1 oraz mutacji w genie PRX, nie dała jednak jednoznacznych wyników dla innych wariantów.

Analiza in vitro zmutowanej formy białka GDAP1 (c.347C>T; Met116Thr) w hodowlach komórkowych wykazała podobny poziom ekspresji w komórkach z dziką i zmutowaną formą białka. Mutacja Met116Thr nie zmienia także lokalizacji białka GDAP1 w komórce. Badanie immunocytochemiczne w przypadku mutacji c.1194_1197delTTCC; Ser399fsX410 w genie PRX z przeciwciałami przeciw części N i C-końcowej oraz domenie powtórzeniowej białka L-PRX wykazało spodziewane skrócenie białka L-PRX i potwierdziło patogenność mutacji.

Na podstawie otrzymanych wyników oraz danych literaturowych zaproponowano algorytm diagnostyki molekularnej (ryc. 3), uwzględniający w pierwszej kolejności badanie duplikacji regionu 17p11.2-p12 oraz genów w których stwierdzono najwyższy odsetek mutacji patogennych.

DYSKUSJA

Najczęściej występującymi formami CMT są neuropatie o dziedziczeniu dominującym, szczególnie postać CMT1A (30-40%), która w badaniach niemieckich stanowiła nawet do 70% wszystkich przypadków CMT (19). Około 90% przypadków CMT1A spowodowanych jest duplikacją 1,5 Mb regionu na chromosomie 17 (17p11.2-p12), w obrębie, którego znajduje się gen PMP22 (20, 21). Większość przypadków dziedzicznych neuropatii obejmuje formy demielinizacyjne stanowiące nawet do 90% badanych chorych. Najczęstsze są neuropatie o dziedziczeniu dominującym. Wśród nich największy odsetek mutacji stwierdza się w genach Cx32 (8,8-12%), MPZ (2,9-5%) i PMP22 (1,5-2,5%) (19, 22). Pośród aksonalnych form neuropatii postać CMT2A – gen MFN2 stanowi 20-30% (głównie w przypadkach rodzinnych) (22). Z powyższych względów, a także z powodu występowania „pseudorecesywności” w rodzinach z CMT1A, w których chorzy rodzice mają poronne objawy choroby oraz występowania recesywnych form neuropatii w przypadku mutacji w niektórych genach odpowiedzialnych za neuropatie o dziedziczeniu dominującym, diagnostyka molekularna (ryc. 3) w kierunku wszystkich form neuropatii, nie tylko recesywnych, powinna  uwzględniać w pierwszej kolejności badanie duplikacji regionu 17p11.2-p12 oraz genów o najwyższym odsetku stwierdzanych mutacji. Tym bardziej, że w populacjach takich jak polska występują przede wszystkim przypadki sporadyczne (92%). Rodziny z prawdopodobnym dziedziczeniem autosomalnym recesywnym stanowiły zaledwie 8% grupy badanej. W pięciu z tych rodzin stwierdzono występowanie dziedziczenia autosomalnie dominującego i praktycznie bezobjawowych rodziców probantów. W trzech przypadkach zidentyfikowano de novo duplikację regionu 17p11.2-p12.

Z uwagi na wysoką częstość występowania mutacji w genie GDAP1, wynikającą z badań populacji polskiej oraz opisywaną w innych populacjach europejskich,  badanie chorych z podejrzeniem neuropatii CMT o dziedziczeniu autosomalnym recesywnym powinno w pierwszej kolejności uwzględniać analizę właśnie tego genu.

Po szczegółowym zapoznaniu się z wynikami badań klinicznych, elektrofizjologicznych i w miarę możliwości histopatologicznych, następnym krokiem, jest wybranie do badań kolejnych genów, których mutacje zaangażowane są w powstanie recesywnych form neuropatii. Przy wyborze genów do badań należy mieć na uwadze częstość mutacji w tych genach oraz występowanie danej postaci CMT w różnych populacjach.

Warianty sekwencyjne stwierdzane w genach GDAP1, PRX, EGR2 i CTDP1 zaliczyć można do trzech grup: zmiany patogenne, zmiany polimorficzne oraz warianty o niewyjaśnionym statusie.

Do pierwszej grupy mutacji patogennych zaliczone zostały mutacje segregujące w rodzinach z chorobą (homozygotyczne u chorych i heterozygotyczne u zdrowych rodziców), powodujące zmiany aminokwasów o wysokim konserwowaniu międzygatunkowym, nieobecne w grupie kontrolnej, ani w bazie danych SNP. Istotnym wykładnikiem patogenności zmian sekwencyjnych jest również ich występowanie w różnych niespokrewnionych rodzinach. Przykładem jest mutacja Met116Thr w genie GDAP1 (17), która opisana została także przez Di Maria i wsp. 2004 (23) oraz Biancheriego i wsp. 2006 (24) jednak dotyczyła innej zmiany nukleotydowej (c.347T>G) powodującej podstawienie metioniny argininą (Met116Arg). Natomiast mutacje c.715C>T, Leu239Phe (25) opisano uprzednio u pacjentów w złożonej heterozygocie (26, 27). W grupie badanej występuje jeden przypadek mutacji w genie GDAP1 występujący w układzie heterozygoty złożonej (311-1G>A/Ser130Cys) (28). Dla przykładu w genie GDAP1 opisano dziewięć przypadków z mutacjami w złożonej heterozygocie (29). Występowanie u chorych z AR-CMT mutacji w genie GDAP1 w konfiguracji heterozygoty złożonej utrudnia diagnostykę recesywnych form neuropatii zwłaszcza przy wstępnym zawężaniu grupy do badań za pomocą metody mapowania homozygotyczności. W ten sposób jednak przypadki z mutacjami w układzie heterozygotycznym pozostają niejako „poza” diagnostyką. Istotne znaczenie dla określenia patogenności zidentyfikowanej zmiany, ma również korelacja mutacji z charakterystycznymi dla danego fenotypu cechami klinicznymi, elektrofizjologicznymi i morfologicznymi opisywanymi w literaturze dla danej jednostki chorobowej. Mutacja w genie PRX Ser399fs410X charakteryzuje się bardzo podobnym fenotypem do opisywanych w przypadkach innych tego typu zmian (Arg196X oraz Arg1070X) (30, 31, 18).

Istotnych argumentów przemawiających za patogennością mutacji może dostarczyć analiza funkcjonalna mutacji. Nie zawsze jednak możliwe jest przeprowadzenie badań funkcjonalnych, a wyniki bywają niejednoznaczne i nieinformatywne. Dlatego coraz częściej „sięga się” po narzędzia bioinformatyczne, szczególnie służące do analizy miejsc splicingowych, sekwencji regulatorowych i specyficznych domen białkowych. Wyniki otrzymywane za pomocą metod analizy in silico niestety często wykazują niezgodność pomiędzy używanymi programami. Zastosowana analiza bioinformatyczna wariantów sekwencji genów: GDAP1, PRX, EGR2 oraz CTDP1 potwierdziła patogenną rolę pięciu mutacji w genie GDAP1 oraz dwóch w genie PRX, nie dała jednak jednoznacznych wyników dla innych wariantów sekwencyjnych. Dostarczyła jedynie pewnych przesłanek co do ich charakteru. Siedem wariantów określono jako polimorficzne, natomiast 16 sklasyfikowano jako warianty o nieokreślonym statusie.

Trudną do rozstrzygnięcia kwestią jest zaliczenie wariantów sekwencyjnych do „niewinnych” polimorfizmów bądź zmian o nieznanym statusie, które potencjalnie mogłyby być patogenne, lub zwiększać ryzyko choroby (32). Przykładem negatywnego wpływu „niewinnego” polimorfizmu na specyficzność substratową jest zmiana c.3435C>T w genie MDR1 (33). Polimorfizm 3435C>T opisano w związku z zaburzeniem aktywności i funkcji białka P-gp (produkt genu MDR1). Polimorfizm ten zmienia wrażliwość białka P-gp na inhibitor – verapamil i zmniejsza wrażliwość białka na trypsynę. Badacze sugerują możliwy wpływ polimorfizmu 3435C>T na konformację białka P-gp. Z drugiej strony opisuje się mutacje zmiany sensu jak, np. Glu318Gly w genie PSEN1, do niedawna uważana za zmianę patogenną powodującą chorobę Alzheimera, obecnie traktowana jest jako polimorfizm (34).

W dobie „postgenomowej” coraz trudniejsze staje się określenie charakteru patogennego mutacji. Paradoksalnie postępowi technologicznemu w zakresie detekcji wariantów sekwencyjnych nie towarzyszy równie dynamiczny rozwój badań nad interpretacją wyników analiz molekularnych (mutacja patogenna/polimorfizm). Niejasny status wariantów sekwencyjnych stwarza wiele problemów diagnostycznych, znacznie utrudniających poradnictwo genetyczne. Dotychczasowy, tradycyjny sposób pojmowania patogenności jako zmiany aminokwasowej stał się dalece niewystarczający, a warianty występujące poza obszarami kodującymi i nie powodujące podstawień aminokwasowych są trudne w interpretacji. Badania funkcjonalne i analiza bioinformatyczna, mimo iż pomocne, nie mogą być jednak traktowane jako narzędzia diagnostyczne. Stanowią one jedynie cenną wskazówkę dla ukierunkowania dalszych badań.

Stworzenie algorytmu diagnostyki molekularnej w AR-CMT wymaga uwzględnienia podstawowych kryteriów: heterogenności genetycznej i klinicznej choroby; występowania miejsc o podwyższonej częstości mutacji tzw. „hot spot” w obrębie genów i znajomości korelacji genotypowo-fenotypowych. Na obecnym etapie rozwoju wiedzy powyższe kryteria są trudne do spełnienia w odniesieniu do AR-CMT i dlatego zaproponowany algorytm jest daleki od doskonałości.

Wyniki badań stanowią istotny wkład w badanie podłoża molekularnego chorób kręgu Charcot-Marie-Tooth o dziedziczeniu autosomalnym recesywnym w populacji polskiej.

Konstrukcja ostatecznego modelu diagnostyki molekularnej w AR-CMT wydaje się niemożliwa ze względu na trudności w interpretacji uzyskanych wyników analizy molekularnej (mutacja patogenna/polimorfizm/wariant sekwencyjny o nieznanej patogenności).

WNIOSKI

Wyniki badań stanowią istotny wkład w badanie podłoża molekularnego chorób kręgu Charcot-Marie-Tooth o dziedziczeniu autosomalnym recesywnym w populacji polskiej.

Konstrukcja ostatecznego modelu diagnostyki molekularnej w AR-CMT wydaje się niemożliwa ze względu na trudności w interpretacji uzyskanych wyników analizy molekularnej (mutacja patogenna/polimorfizm/wariant sekwencyjny o nieznanej patogenności).

..............................................................................................................................................................

Podziękowania

Autorzy pracy dziękują pacjentom i ich rodzinom za współpracę w prowadzonych badaniach. Składamy również podziękowania pani Jadwidze Kędzierskiej i pani mgr Izabeli Moszyńskiej za pomoc techniczną.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.     Dubourg O., Azzedine H., Verny C., Durosier G., Birouk N., Gouider R., Salih M., Bouhouche A., Thiam A., Grid D., Mayer M., Ruberg M., Tazir M., Brice A.,LeGuern E.: Autosomal-recessive forms of demyelinating Charcot-Marie-Tooth disease. Neuromolecular. Med., 2006, 8 (1-2), 75-86.

2.     Kochański A.: Choroby kręgu Charcot-Marie-Tooth o dziedziczeniu recesywnym. Neurologia Dziecięca, 2006, 15 (29), 19-25.

3.     Barisic N., Claeys K.G., Sirotkovic-Skerlev M., Lofgren A., Nelis E., De Jonghe P., Timmerman V.: Charcot-Marie-Tooth disease: a clinico-genetic confrontation. Ann. Hum. Genet., 2008, May, 72 (Pt 3), 416-441.

4.     Dejerine J., Sottas J.: Sur la nevrite interstitielle hypertrophique et progressive de l’enfance. Comp. Rend. Soc. Biol., 1893, 45 63-96.

5.     OMIM GDAP1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=606598

6.     Niemann A., Ruegg M., La P., V, Schenone A., Suter U.: Ganglioside-induced differentiation associated protein 1 is a regulator of the mitochondrial network: new implications for Charcot-Marie-Tooth disease. J. Cell Biol., 2005, Sep, 170 (7), 1067-1078.

7.     Sherman D.L., Fabrizi C., Gillespie C. S.,Brophy P.J.: Specific disruption of a schwann cell dystrophin-related protein complex in a demyelinating neuropathy. Neuron, 2001, Jun, 30 (3), 677-687.

8.     OMIM PRX http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=605725

9.     Topilko P., Schneider-Maunoury S., Levi G., Baron-Van Evercooren A., Chennoufi A.B., Seitanidou T., Babinet C., Charnay P.: Krox-20 controls myelination in the peripheral nervous system. Nature, 1994, Oct, 371 (6500), 796-799.

10.     Parkinson D.B., Dickinson S., Bhaskaran A., Kinsella M.T., Brophy P.J., Sherman D.L., Sharghi-Namini S., Duran Alonso M.B., Mirsky R., Jessen K.R.: Regulation of the myelin gene periaxin provides evidence for Krox-20-independent myelin-related signalling in Schwann cells. Mol. Cell Neurosci., 2003, May, 23 (1), 13-27.

11.     OMIM EGR2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=129010

12.     OMIM CTDP1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=604927

13.     Kalaydjieva L.: Congenital cataracts – facial dysmorphism – neuropathy. Orphanet. J. Rare. Dis., 2006, 1, 32-36.

14.     Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F.: A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res., 1988, Feb, 16 (3), 1215.

15.     Stronach E.A., Clark C., Bell C., Lofgren A., McKay N.G., Timmerman V., Van Broeckhoven C., Haites N.E.: Novel PCR-based diagnostic tools for Charcot-Marie-Tooth type 1A and hereditary neuropathy with liability to pressure palsies. J. Peripher. Nerv. Syst., 1999, 4 (2), 117-122.

16.     Aarskog N.K., Vedeler C.A.: Real-time quantitative polymerase chain reaction. A new method that detects both the peripheral myelin protein 22 duplication in Charcot-Marie-Tooth type 1A disease and the peripheral myelin protein 22 deletion in hereditary neuropathy with liability to pressure palsies. Hum. Genet., 2000, Nov, 107 (5), 494-498.

17.     Kabzinska D., Kochanski A., Drac H., Rowinska-Marcinska K., Ryniewicz B., Pedrola L., Palau F., Hausmanowa-Petrusewicz I.: A novel Met116Thr mutation in the GDAP1 gene in a Polish family with the axonal recessive Charcot-Marie-Tooth type 4 disease. J. Neurol. Sci., 2006, Feb, 241 (1-2), 7-11.

18.     Kabzinska D., Drac H., Sherman D.L., Kostera-Pruszczyk A., Brophy P.J., Kochanski A., Hausmanowa-Petrusewicz I.: Charcot-Marie-Tooth type 4F disease caused by S399fsx410 mutation in the PRX gene. Neurology, 2006, Mar, 66 (5), 745-747.

19.     Nelis E., Van Broeckhoven C., De Jonghe P., Lofgren A., Vandenberghe A., Latour P., Le Guern E., Brice A., Mostacciuolo M.L., Schiavon F., Palau F., Bort S., Upadhyaya M., Rocchi M., Archidiacono N., Mandich P., Bellone E., Silander K., Savontaus M.L., Navon R., Goldberg-Stern H., Estivill X., Volpini V., Friedl W., Gal A.: Estimation of the mutation frequencies in Charcot-Marie-Tooth disease type 1 and hereditary neuropathy with liability to pressure palsies: a European collaborative study. Eur. J. Hum. Genet., 1996, 4 (1), 25-33.

20.     Lupski J.R., Oca-Luna R.M., Slaugenhaupt S., Pentao L., Guzzetta V., Trask B.J., Saucedo-Cardenas O., Barker D.F., Killian J.M., Garcia C.A., Chakravarti A., Patel P.I.: DNA duplication associated with Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Cell, 1991, Jul, 66 (2), 219-232.

21.     Roa B.B., Garcia C.A., Suter U., Kulpa D.A., Wise C.A., Mueller J., Welcher A.A., Snipes G.J., Shooter E.M., Patel P.I., Lupski J.R.: Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Association with a spontaneous point mutation in the PMP22 gene. N. Engl. J. Med., 1993, Jul, 329 (2), 96-101.

22.     Szigeti K., Nelis E., Lupski J.R.: Molecular diagnostics of Charcot-Marie-Tooth disease and related peripheral neuropathies. Neuromolecular. Med., 2006, 8 (1-2), 243-254.

23.     Di Maria E., Gulli R., Balestra P., Cassandrini D., Pigullo S., Doria-Lamba L., Bado M., Schenone A., Ajmar F., Mandich P., Bellone E.: A novel mutation of GDAP1 associated with Charcot-Marie-Tooth disease in three Italian families: evidence for a founder effect. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 2004, Oct, 75 (10), 1495-1498.

24.     Biancheri R., Zara F., Striano P., Pedemonte M., Cassandrini D., Stringara S., Manganelli F., Santoro L., Schenone A., Bellone E.,Minetti C.: GDAP1 mutation in autosomal recessive Charcot-Marie-Tooth with pyramidal features. J. Neurol., 2006, Sep, 253 (9), 1234-1235.

25.     Kabzinska D., Drac H., Rowinska-Marcinska K., Fidzianska A., Kochanski A., Hausmanowa-Petrusewicz I.: Early onset Charcot-Marie-Tooth disease caused by a homozygous Leu239Phe mutation in the GDAP1 gene. Acta Myol., 2006, Jun, 25 (1), 34-37.

26.     Sandre-Giovannoli A., Chaouch M., Boccaccio I., Bernard R., Delague V., Grid D., Vallat J.M., Levy N.,Megarbane A.: Phenotypic and genetic exploration of severe demyelinating and secondary axonal neuropathies resulting from GDAP1 nonsense and splicing mutations. J. Med. Genet., 2003, Jul, 40 (7), e87-e94.

27.     Ammar N., Nelis E., Merlini L., Barisic N., Amouri R., Ceuterick C., Martin J.J., Timmerman V., Hentati F., De Jonghe P.: Identification of novel GDAP1 mutations causing autosomal recessive Charcot-Marie-Tooth disease. Neuromuscul. Disord., 2003, Nov, 13 (9), 720-728.

28.     Kabzinska D., Kochanski A., Drac H., Ryniewicz B., Rowinska-Marcinska K., Hausmanowa-Petrusewicz I.: Autosomal recessive axonal form of Charcot-Marie-Tooth Disease caused by compound heterozygous 3‘-splice site and Ser130Cys mutation in the GDAP1 gene. Neuropediatrics, 2005, Jun, 36 (3), 206-209.

29.     Inherited Peripheral Neuropathies Mutation Database IPNMD www.molgen.ua.ac.be/CMTMutations/default.cfm,2007

30.     Guilbot A., Williams A., Ravise N., Verny C., Brice A., Sherman D.L., Brophy P.J., LeGuern E., Delague V., Bareil C., Megarbane A., Claustres M.: A mutation in periaxin is responsible for CMT4F, an autosomal recessive form of Charcot-Marie-Tooth disease. Hum. Mol. Genet., 2001, Feb, 10 (4), 415-421.

31.     Kijima K., Numakura C., Shirahata E., Sawaishi Y., Shimohata M., Igarashi S., Tanaka T., Hayasaka K.: Periaxin mutation causes early-onset but slow-progressive Charcot-Marie-Tooth disease. J. Hum. Genet., 2004, 49 (7), 376-379.

32.     Kochanski A.: Pathogenic mutations and non-pathogenic DNA polymorphisms in the most common neurodegenerative disorders. Folia Neuropathologica, 2007, 45 (4), 164-165.

33.     Kimchi-Sarfaty C., Oh J.M., Kim I.W., Sauna Z.E., Calcagno A.M., Ambudkar S.V., Gottesman M.M.: A „silent“ polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science, 2007, Jan, 315 (5811), 525-528.

34.     Zekanowski C., Peplonska B., Styczynska M., Religa D., Pfeffer A., Czyzewski K., Gabryelewicz T., Szybinska A., Kijanowska-Haladyna B., Kotapka-Minc S., Luczywek E., Barczak A., Wasiak B., Chodakowska-Zebrowska M., Przekop I., Kuznicki J.,Barcikowska M.: The E318G substitution in PSEN1 gene is not connected with Alzheimer‘s disease in a large Polish cohort Neurosci. Lett., 2004, Mar, 357 (3), 167-170.

..............................................................................................................................................................

Adres do korespondencji:

Andrzej Kochański
Zespół Chorób Nerwowo-Mięśniowych
Instytutu Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej
im. M.J. Mossakowskiego Polskiej Akademii Nauk
ul. A. Pawińskiego 5, 02-106 Warszawa
tel./fax (0-22) 60-86-506
andko@cmdik.pan.pl