*Praca finansowana z grantu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego PBZ-KBN-122/P05/2004

WSTĘP

Dystrofia mięśniowa Duchenen’a/Beckera (DMD MIM 310200; BMD MIM 300376) jest postępującym i nieodwracalnym zanikiem mięśni, która w ostrej postaci (typ Duchenne’a) występuje u chłopców z częstością 1:3500, a w łagodniejszej postaci (typ Beckera) z częstością 1:18 500 żywych urodzeń (1). Choroba wykazuje typ dziedziczenia recesywny sprzężony z chromosomem X. Najczęściej pacjent przestaje chodzić około 10 roku życia, a śmierć następuje zazwyczaj około 20-go roku życia. Największą liczbę mutacji (około 60%) wywołujących DMD/BMD stanowią delecje, różniące się wielkością, obejmujące jeden lub większą liczbę spośród 79 eksonów genu dystrofiny. Delecje najczęściej występują w jednym z dwóch tzw. gorących miejsc, położonych pomiędzy eksonami 44 – 52 i 3 – 19, dzięki czemu analiza PCR multiplex obejmująca jedynie 18 eksonów pozwala na wykrycie 98% delecji (2-5). Duplikacje fragmentów genu są przyczyną 5-10% zachorowań. Pozostałe przypadki choroby wywołane są mutacjami punktowymi lub mikrouszkodzeniami – delecjami, duplikacjami, insercjami, inwersjami, jednego lub kilku nukleotydów – występującymi w obrębie całego genu (6, 7, 8). Produktem genu, o którym mowa, jest białko – dystrofina, odpowiedzialne za łączenie białek cytoszkieletu z zewnątrzkomórkową macierzą poprzez kompleks glikoproteinowy usytuowany w sarkolemmie (9). Zgodnie z teorią Monaco (10) mutacje naruszające ramkę odczytu genu powodują cięższą postać choroby – DMD – z brakiem dystrofiny we włóknach mięśniowych, a mutacje zachowujące ramkę odczytu wywołują łagodniejszą postać dystrofii – BMD, w której występuje defektywna dystrofina o częściowo, w różnym stopniu, zachowanej funkcji.

CEL

Celem przeprowadzonych badań było wykrycie mutacji: rzadkich delecji, duplikacji i mutacji punktowych w genie dystrofiny u osób z rozpoznaniem dystrofii mięśniowej Duchenne’a/Beckera, u których uprzednio wykluczono obecność najczęstszych stanowiących około 98% delecji.

MATERIAŁ

Materiałem do badań były próbki DNA wyizolowanego z leukocytów krwi obwodowej pochodzące od 115 osób, w tym dotkniętych DMD – 105 i BMD – 10. U pacjentów tych uprzednio, w standardowym badaniu metodą PCR-multiplex wykluczono najczęstsze delecje w genie dystrofiny.

W skład analizowanej grupy wchodziły osoby, u których rozpoznanie dystrofii mięśniowej postawione zostało przez doświadczonych klinicystów na podstawie obrazu klinicznego i analizy immunohistochemicznej dystrofiny w wycinkach mięśni. W części przypadków o trafności rozpoznania DMD/BMD świadczyły także rodowody o segregacji typowej dla dziedziczenia recesywnego sprzężonego z chromosomem X.

METODY

Wykrywanie rzadkich delecji i duplikacji

W celu wykrycia rzadkich delecji i duplikacji w genie dystrofiny badanych pacjentów zastosowano technikę MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) (11). Produkty reakcji rozdzielano w aparacie płytowym ABI Prism 377 DNA Sequencer firmy Applied Biosystem.

Poszukiwanie mutacji punktowych

U pacjentów, u których nie wykryto rzadkich delecji lub duplikacji poszukiwano mutacji punktowych. W celu wyselekcjonowania fragmentów genu dystrofiny ze zmienioną sekwencją nukleotydową analizowano pojedyncze amplikony techniką SSCP. Analiza ta objęła następujące eksony: 1-4, 6-8, 11-13, 17, 19-22, 29, 34, 39, 42-55, 60-79. Produkty PCR, denaturowane termicznie w obecności formamidu, rozdzielano w żelach MDE (zmodyfikowany poliakryloamid firmy Cambrex Bio Science), zgodnie z zaleceniami producenta, i barwiono azotanem srebra. Amplikony o zmienionej ruchliwości elektroforetycznej poddawano sekwencjonowaniu metodą automatycznego odczytywania sekwencji DNA z zastosowaniem aparatury ABI Prism 377 DNA Sequencer Applied Biosystem.

WYNIKI

U 115 osób wykryto 10 rzadkich delecji (9%) (tab. I) i 14 duplikacji (12%) (tab. II). Zidentyfikowane duplikacje obejmują eksony pomiędzy 2-62; większość z nich wystąpiła w proksymalnej części genu (11 z 14), a połowa duplikacji obejmuje więcej niż 10 eksonów (tab. II).

Poszukując u 91 pacjentów mutacji punktowych wykryto: 14 mutacji punktowych lub mikrodelecji (12% badanego materiału) z czego 11 to mutacje nowo odkryte (ang. novel mutations), położone w eksonach: 6, 39, 45, 51, 52, 55, 62, 63, 68 (dwie różne) i 70 (6) (tab. III).

DYSKUSJA

DMD i BMD są allelicznymi postaciami dystrofii mięśniowej wywoływanymi mutacjami w genie dystrofiny. Ogólnie przyjmuje się, że przyczynami około 60% przypadków choroby są delecje, 5-10% – duplikacja, a w pozostałych 30-35% – mutacje punktowe lub mikrouszkodzenia (6). Identyfikacja 98% wszystkich delecji jest stosunkowo prosta. Dokonuje się jej za pomocą standardowego PCR-multiplex z zastosowaniem par starterów służących do amplifikacji 18 eksonów (4, 5). Natomiast wykrycie reszty rzadkich delecji wymaga rozszerzenia metody o analizę pozostałych 61 eksonów genu dystrofiny, np. za pomocą techniki MLPA.

W naszym materiale zidentyfikowaliśmy tą metodą 10 rzadkich delecji (9%) z czego tylko dwie były wcześniej opisane (6). Nowo wykryte delecje rozproszone są w obrębie całego genu w przeciwieństwie do duplikacji zlokalizowanych w jego proksymalnej części – zgodnie z doniesieniami innych autorów (12).

W badanym materiale w zdecydowanej większości obserwujemy zgodność z teorią Monako mówiącą o zasadach powodujących powstawanie ciężkiej bądź łagodniejszej postaci choroby (10). Wyjątkiem jest delecja 3 nukleotydów w eksonie 70, która mimo iż zachowuje ramkę odczytu i usuwa z białka tylko jeden aminokwas – kwas glutaminowy – powoduje uszkodzenie odcinka odpowiedzialnego za wiązanie dystrofiny do dystroglikanów śródbłonowego kompleksu DGC i wywołuje ostrą postać choroby. W dwóch przypadkach duplikacje obejmujące znaczną część genu dystrofiny (pacjenci 18 i 19) pomimo zachowania ramki odczytu zmieniają najpewniej w istotny sposób cząsteczkę białka powodując utratę jego funkcji i wywołują ciężką postać choroby – DMD.

Podsumowując w badanym materiale wśród 115 osób dotkniętych DMD/BMD, u których uprzednio wykluczono częstsze delecje za pomocą standardowej metodu PCR-multiplex, wykryto 10 przypadków rzadkich delecji, 14 duplikacji i 14 mutacji punktowych lub mikrodelecji. Tak więc u 38 na 115 osób (33%) ustalono molekularne podłoże choroby. Pozostaje zatem 77 osób chorych, u których mutacja (najpewniej punktowa) nie została jeszcze zidentyfikowana. Podkreślić jednak należy, że w niniejszej pracy analizą SSCP i sekwencjonowaniem objęto tylko niektóre, arbitralnie wybrane części genu dystrofiny.

Ze względu na wysoką częstość nowych mutacji (około 1/3 przypadków) oraz wysoki poziom rekombinacji wewnątrz genu (10%) (13, 14) badanie nosicielstwa za pomocą analizy dziedziczenia haplotypów jest trudne, pracochłonne i niejednokrotnie wyniki są trudne do interpretacji. Dzięki przeprowadzonym badaniom w rodzinach z wykrytą rzadką delecją, duplikacją lub mutacją punktową rozszerza się możliwość badania nosicielstwa i diagnostyki prenatalnej.

Ponadto należy dodać, że od kilku lat prowadzone są badania zmierzające do uzyskania efektywnej metody leczenia chorych dotkniętych DMD za pomocą modyfikacji składania mRNA i syntezy dystrofiny. Podejście to zwane „exon skipping” polega na ingerencji w proces składania mRNA, w taki sposób, aby przywrócić fazę odczytu i tym samym zamienić ostrą postać choroby DMD w typ łagodniejszy – a więc w BMD. W tym celu, w zależności od typu mutacji występującej u osoby chorej, proponuje się usunięcie eksonu zawierającego kodon stop (w przypadku mutacji punktowej typu nonsens) lub też usunięcie eksonu sąsiadującego bezpośrednio z delecją lub duplikacją naruszającą ramkę odczytu (15). Drugi rodzaj podejścia terapeutycznego polega na zastosowaniu preparatu nazwanego ataluren (uprzednio PTC124™), powodującego pomijanie podczas translacji przez rybosomy, powstałego na skutek mutacji, kodonu stop. Prowadzi to do syntezy białka pełnej długości (16). Do tych eksperymentalnych metod terapii kwalifikowani są pacjenci z precyzyjnie
określonym miejscem i charakterem mutacji.

WNIOSKI

1.    W badanej wyselekcjonowanej grupie chorych dotkniętych dystrofią mięśniową Duchenne’a/Beckera, u których uprzednio za pomocą techniki PCR-multiplex wykluczono najczęstsze delecje zastosowano metodę MLPA i potwierdzono wysoką efektywność tej metody w wykrywaniu delecji i duplikacji w genie dystrofiny.

2.    Wyniki przeprowadzonych badań skłaniają nas do wprowadzenia zmian w procedurze diagnostycznej DMD/BMD, w której dotychczas stosowano standardowo metodę PCR-multiplex wykrywającą najczęstsze delecje. Zastąpienie dotychczasowej analizy DNA techniką MLPA stwarza możliwości wykrywania wszystkich delecji oraz duplikacji i znacznie skraca czas badania diagnostycznego.  

3.    Identyfikacja większości mutacji w genie dystrofiny ma duże znaczenie praktyczne dla prowadzenia badań pod kątem nosicielstwa zmutowanego genu dystrofiny i diagnostyki prenatalnej, a ponadto pozwala na kwalifikowanie poszczególnych pacjentów do podejmowanych ostatnio nowych prób terapii genowej.

..............................................................................................................................................................

Podziękowania

Autorzy pracy pragną wyrazić podziękowanie dr. hab. Markowi Kacińskiemu i dr Alicji Kubik (Uniwersytecki Szpital Kliniczny CMUJ), dr hab. Maciejowi Krawczyńskiemu (Centrum Genetyki Medycznej NZOZ, Poznań), dr Jolancie Wierzbie (Akademickie Centrum Kliniczne, Szpital AMG) i Pani Annie Rybińskiej (Instytut Centrum Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. M. Mossakowskiego PAN) za skierowanie pacjentów dotkniętych DMD/BMD do Poradni Genetycznej Instytutu Psychiatrii i Neurologii.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Emery A.E.H.: Duchenne Muscular Dystrophy. Oxford Monographs On Molecular Genetics no 24, Secondo Editio, Oxford University Press, 1993.

2.    Darras B.T., Koenig M., Kunkel L.M., Francke U.: Direct method for prenatal diagnosis and carrier detection in Duchenne/Becker muscular dystrophy using the entire dystrophin cDNA. Am. J. Med. Genet., 1988, 29, 713-726.

3.    Multicenter Study Group: Diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophies by polymerase chain reaction. JAMA, 1992, 267, 2609-2615.

4.    Beggs A.H., Koenig M., Boyce F.M., Kunkel L.M.: Detection of 98% of DMD/BMD gene deletions by polymerase chain reaction. Hum. Genet., 1990, 86(1), 45-48.

5.    Chamberlain J.S., Gibbs R.A., Ranier J.E., Caskey C.T.: Multiplex PCR for the diagnosis of Duchenne muscular dystrophy. In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Eds; MA Innis, DH Gelfand, JJ Sninsky, TJ White), Academic Press, San Diego (USA), 1990, 272-281.

6.    Strona www.dmd.nl

7.    Kekou K., Mavrou A., Florentyn L., Youroukos S., Zafiriou D.I., Skouteli H.N., Metaxotou C.: Screening for minor changes in the distal part of the human dystrophin gene in Greek DMD/BMD patients. Eur. J. Hum. Genet., 1999, 7, 179-187.

8.    Chaturvedi L.S., Mukherjee M., Srivastava S., Mittal R.D., Mittal B.: Point mutation and polymorphism in Duchenne/Becker muscular dystrophy (D/BMD) patients. Exp. Mol. Med., 2001, 33(4), 251-256.

9.    Ervasti J.M., Campbell K.P.: Membrane organization of the dystrophin-glycoprotein complex. Cell. 1991, 66, 1121-1131.

10.    Monaco A.P., Bertelson C.J., Liechti-Gallati S., Moser H., Kunkel L.M.: An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics, 1988, 2, 90-95.

11.    Gatta V., Scarciolla O., Gaspari A.R., Palka C., De Angelis M.V., Di Muzio A., Guanciali-Franchi P., Calabrese G., Uncini A., Stuppia L.: Identification of deletions and duplications of the DMD gene in affected males and carrier females by multiple ligation probe amplification (MLPA). Hum. Genet., 2005, 117, 92-98.

12.    Lai K.K.S., Lo I.F.M., Tong T.M.F., Cheng L.Y.L., Lam S.T.S.: Detecting exon deletions and duplications of DMD gene using Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). Clinical Biochemistry, 2006, 39, 367-372.

13.    Abbs S., Roberts R.G., Mathew C.G., Bentley D.R. and Bobrow M.: Accurate assessment of intragenic recombination frequency within the Duchenne muscular dystrophy gene. Genomics, 1990, 7, 602-606.

14.    Oudet C., Hanauer H., Clemens P., Caskey T., Mandel J.L.: Two hot spots of recombination in the DMD gene correlate with the deletion prone regions. Hum. Mol. Genet., 1992, 1, 599-603.

15.    Aartsma-Rus A., van Ommen G.J.B.: Antisense-mediated exon skipping: A versatile tool with therapeutic and research applications. RNA, 2007, 13, 1609-1624.

16.    Wilton S.: PTC124, nonsense mutations and Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul. Disord., 2007, 17(9-10), 719-720.

..............................................................................................................................................................

Adres do korespondencji:

Janusz Zimowski
Zakład Genetyki, Instytut Psychiatrii
i Neurologii
Al. Sobieskiego 9, 02-957 Warszawa
tel. (0-22) 458-28-56