*Praca finansowana z grantu nr PBZ-KBN-122-P05/2004 Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego

WSTĘP

Dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa (G6PD) jest pierwszym enzymem szlaku pentozowego przemiany glukozy, redukującego NADP do formy NADPH, posiadającej silne działanie antyoksydacyjne. Niedobór G6PD, uniemożliwia krwince czerwonej wytworzenie takiej ilości NADPH, które w wystarczający sposób chroniłoby krwinkę przed stresem oksydacyjnym. Niedobór G6PD dotyczy ponad 400 milionów ludzi na świecie. Swoim zasięgiem obejmuje głównie rejony tropikalne, występując w pozostałych rejonach ze zróżnicowaną częstością. Opisano ponad 400 wariantów G6PD, które podzielono na 5 klas w zależności od poziomu aktywności G6PD i objawów klinicznych (1).

Ludzki monomer G6PD składa się z 515 aminokwasów, a jego masa cząsteczkowa wynosi 59KDa. G6PD jest aktywny w krwinkach czerwonych tylko jako tetrametr bądź dimer (2).

Gen g6pd znajduje się w długim ramieniu chromosomu X w regionie q28 (Xq28). Lokalizacja genu na chromosomie X jest przyczyną występowania pełnego obrazu choroby u osób płci męskiej. U osób płci żeńskiej, w przypadku mutacji na jednym allelu,  we krwi obwodowej znajdują się dwie populacje krwinek czerwonych: jedna całkowicie prawidłowa a druga z niedoborem G6PD, co powoduje że heterozygoty nie wykazują pełnych objawów klinicznych niedoboru G6PD. Gen g6pd zawiera 13 exonów oraz 12 intronów. Niedobór G6PD jest genetycznie heterogeniczny. Poznano około 130 różnych mutacji. Badania molekularne wykazały, że niektórym mutacjom odpowiada po kilka uprzednio opisanych wariantów biochemicznych G6PD.

Mutacje dotyczą regionu kodującego lub promotora, w większości przypadków są to mutacje typu missense (3).

W poniższej pracy przedstawiamy dwa przypadki wrodzonej niedokrwistości hemolitycznej rozpoznanej w wieku niemowlęcym jako sferocytoza wrodzona, a jak wykazano badaniami biochemicznymi i genetycznymi, spowodowanej niedoborem G6PD.

MATERIAŁ I METODY

Opis przypadku

Przypadek nr 1

Chłopiec S.B., urodził się z ciąży pierwszej przez cięcie cesarskie, które wykonane było z powodu braku postępu porodu oraz wystąpienia objawów zagrożenia płodu (deceleracja). Dziecko urodziło się z cechami hipotrofii wewnątrzmacicznej, w ciężkiej zamartwicy. Po urodzeniu stwierdzono niedokrwistość, stężenie hemoglobiny wynosiło 9,6 g/dl. W okresie niemowlęcym na podstawie obrazu klinicznego, niedokrwistości i hiperbilirubinemii, obecności sferocytów w rozmazie krwi obwodowej oraz nieprawidłowej oporności osmotycznej rozpoznano u chłopca sferocytozę wrodzoną. Przebieg choroby był u chłopca bardzo ciężki. Wielokrotnie z powodu przełomów hemolitycznych wymagał uzupełniających transfuzji koncentratu krwinek czerwonych. Z tego powodu został zakwalifikowany do splenektomii, którą wykonano w 6 roku życia. Po zabiegu oczekiwana poprawa nie wystąpiła. Jako powikłanie po zabiegu obserwowano nadpłytkowość. Nadal występowały kryzy hemolityczne ze znacznym spadkiem stężenia hemoglobiny, retikulocytozą i żółtaczką. W związku z tym konieczna była weryfikacja rozpoznania. Wykonany był przesiewowy test EMA, na podstawie którego stwierdzono brak zaburzeń w białkach cytoszkieletu i błonach krwinek czerwonych. Na tej podstawie wykluczono wcześniejsze rozpoznanie sferocytozy wrodzonej. W toku dalszych badań wykluczono talasemię i niedokrwistość dyserytropoetyczną typu II (CDA II). Wykonano badania aktywności enzymów krwinek czerwonych, które wykazało znaczne obniżenie aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej (G6PD – 0,1 IU/gHb). Pozwoliło to na rozpoznanie wrodzonego ciężkiego niedoboru tego enzymu. Diagnozę potwierdzono badaniem genetycznym, które wykazało obecność wariantu G6PD Madrid– C385W.

Przypadek nr 2

Chłopiec S.K., cioteczny kuzyn chorego przedstawionego, jako przypadek pierwszy urodził się o czasie, w dobrym stanie ogólnym. W okresie okołoporodowym obserwowano u niego nasiloną żółtaczkę. W pierwszym miesiącu życia wystąpiło uogólnione zakażenie wywołane przez Staphylococcus hominis. Towarzyszyła mu głęboka niedokrwistość, stężenie hemoglobiny spadło do 3,3 g/dl. Z tego powodu chłopiec dwukrotnie otrzymał uzupełniająca transfuzję koncentratu krwinek czerwonych. Opierając się na obrazie klinicznym i wywiadzie rodzinnym u chłopca rozpoznano również sferocytozę wrodzoną. Kolejna kryza hemolityczna wystąpiła w 4 roku życia. Stężenie hemoglobiny obniżyło się wówczas do 4,1 g/dL. Chłopca zaczęto przygotowywać do zabiegu usunięcia śledziony. Jednak wobec stwierdzenia u kuzyna chłopca niedoboru G6PD postanowiono zweryfikować rozpoznanie. Na podstawie wyniku testu EMA wykluczono sferocytozę wrodzoną. Natomiast badanie aktywności enzymów wewnątrzkrwinkowych pozwoliło rozpoznać niedobór G6PD (G6PD – 0,32 IU/gHb). Badanie genetyczne potwierdziło obecność wariantu G6PD Madrid C385W.

Dane hematologiczne pacjentów przedstawione są w tabeli I.

Oznaczanie aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej

Aktywność G6PD krwinek czerwonych oznaczano metodą spektrofotometryczną, opracowaną przez Beutler E. (4).

Izolowanie DNA i sekwencjonowanie

DNA izolowano z krwi pobieranej do probówek zawierających EDTA. DNA wyizolowano przy wykorzystaniu zestawu DNA Isolation Kit for Blood/Bone Marrow/ Tissue (Roche, Niemcy).

Łańcuchowa reakcja polimerazy (Polymerase Chain Reaction, PCR) została wykorzystana do amplifikacji fragmentu genu kodującego G6PD, zawierającego eksony 9-12.  PCR wykonano przy użyciu FastStart PCR System (Roche, Niemcy), zgodnie z zaleceniami producenta. Każda mieszanina reakcyjna zawierała 1-100 ng DNA lub 10-250 ng DNA, 2,5 µl 10 × PCR bufor, 1,0 µl Startera 9F:5’ CCTCAGCTTGTTCATCAGAATAG, 1,0 µl Startera 12R: 5’ TGGAGGAGAGGCATGAGGTAGC 3’ (20 pmol/µl) oraz 1 jednostkę enzymu (FastStart Taq DNA Polymerase) w końcowej objętości 25 µl. PCR przeprowadzano na aparacie Mastercycler personal (Eppendorf, Niemcy) stosując następujące warunki: 2-minutową wstępną denaturację w 94°C, a następnie 30 cykli 45 s – 94°C, 45 s 59°C, 45 sek. w temperaturze 72°C oraz końcowe wydłużanie w 72°C przez 5 minut. Produkty PCR analizowano metodą elektroforezy agarozowej. Produkt PCR od chorego zostały zsekwencjonowane na aparacie ABI Prism 377 (Apllied Biosystem, USA).

Zmianę nukleotydową 1155 C>G potwierdzono sekwencjonowaniem niezależnego produktu PCR ze Startera 12R. 

Trójwymiarowa struktura dehydrogenazy – 6-glukozo fosforanowej

Struktura przestrzenna mutanta typu Canton (Arg459Leu) ludzkiej dehydrogenazy G6PD została rozwiązana (2). Formę prawidłową G6PD otrzymano przez wprowadzenie in silico mutacji L459R natomiast białko zmutowane miało wprowadzone dwie mutacje: L459R i C385W. Wpływ mutacji C385W na strukturę białka sprawdzono przeprowadzając obliczenia minimalizacji energii (AMBERFF99 w pakiecie Sybyl8.0, TRIPOS Inc.) dla białka prawidłowego oraz zmutowanego.

WYNIKI

Sekwencjonowanie fragmentu genu G6PD wykazało obecność mutacji 1155 C>G, która powoduje zamianę cysteiny w tryptofan w pozycji 385. Mutacja ta zlokalizowana jest w eksonie 10 i jest przyczyną przewlekłej wrodzonej niedokrwistości hemolitycznej (tab. I).

DYSKUSJA

Niedokrwistości powstające na tle niedoboru enzymów regulujących metabolizm krwinek czerwonych, dotyczą wszystkich procesów biochemicznych jakie zachodzą w krwince i mają wpływ na jej fizjologiczną aktywność. W enzymopatiach czas przeżycia krwinek czerwonych ulega skróceniu. Korelacja pomiędzy stopniem niedoboru enzymu a zaburzeniami metabolicznymi w erytrocytach zależy od roli, jaką pełni zmutowany enzym a także od kompensacyjnego wzrostu syntezy izoenzymu lub wykorzystania alternatywnego szlaku biochemicznego. W większości przypadków nie ma ścisłej zależności między stopniem niedoboru enzymu a obrazem klinicznym (5, 6).

Pełny obraz choroby występuje u osób płci męskiej, czyli hemizygot niedoboru G6PD. U osób płci żeńskiej obecne są dwie populacje krwinek czerwonych, jedna – prawidłowa, druga – pochodząca z klonu komórkowego zawierającego zmutowany gen. Wzajemny stosunek ilościowy obu populacji jest przypadkowy, stąd różna podatność heterozygot na czynniki szkodliwe. Nie ma ścisłej zależności między stopniem niedoboru enzymu a obrazem klinicznym. Każda z mutacji związana jest z różnym stopniem niedoboru G6PD i innym obrazem klinicznym, od ciężkiej niedokrwistości hemolitycznej do postaci bezobjawowej (7).

W Polsce niedobór G6PD występuje stosunkowo rzadko, do tej pory znaleziono 9 odrębnych mutacji, z których najczęściej występuje mutacja 563C→ T (wariant G6PD Mediterranean) z charakterystycznymi objawami fawizmu (8-10).

Wariant G6PD Madrid został po raz pierwszy opisany przez Zarza i wsp. (11). Wariant ten, odpowiadający za ciężką postać choroby, dotychczas na terenie Polski nie był wykrywany. Cys385 zlokalizowana jest w domenie β+α G6PD na pętli łączącej fragmenty βK oraz βL. Pętla ta stanowi element powierzchni oddziaływania dwu monomerów jak również bierze udział w oddziaływaniu dimer – dimer. Wszelkie mutacje polegające na zmianie ładunku lub kształtu (objętości) reszt aminokwasowych deformują powierzchnię dimeru. Zmiany struktury G6PD powstające w wyniku mutacji C385W przedstawione są na rycinie 1 – umieszczona między stronami 138-139. Mutacja C385W powoduje perturbację oddziaływań między monomerami tworzącymi dimer, co może prowadzić do destabilizacji białka.

Dodać należy, że u jednego z badanych pacjentów z przewlekłą niedokrwistością hemolityczną, początkowo rozpoznawano sferocytozę wrodzoną. Z powodu utrzymywania się nasilonej niedokrwistości i żółtaczki wykonano u niego zabieg usunięcia śledziony. U chłopca w dalszym ciągu występuje niedokrwistość hemolityczna oraz jako powikłanie splenektomii wystąpiła nadpłytkowość.

WNIOSKI

1.    Wśród chorych z niedokrwistością hemolityczną o nieustalonej etiologii, niedobór G6PD powinien być brany pod uwagę w rozpoznaniu różnicowym.

2.    Badania molekularne są niezbędne, szczególnie w przypadkach podejrzenia nosicielstwa mutacji w genie G6PD.

..............................................................................................................................................................

Podziękowania

Autorzy dziękują Panu Profesorowi Jerzemu Kościelakowi, za wnikliwe przeczytanie manuskryptu.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.     Beutler E.: Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective. Blood 2008, 111(1), 16-24.

2.    Au S.W.N., Gover S., Lam V.M.S., Adams M.J.: Human glucose-6-phosphate dehydrogenase: the crystal structure reveals a structural NADP+ molecule and provides insights into enzyme deficiency. Structure, 2000, 8, 293-303.

3.    Mehta A., Mason P.J., Vulliamy T.J.: Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency. Baillieres Best Pract. Res. Clin. Haematol., 2000, 13, 21-38.

4.    Jabłońska-Skwiecińska E., Maciąg M., Płochocka D., Czajkowska-Mendek E., Zdebska E., Burzyńska B.: Mutacja G1529A genu kinazy pirogronianowej krwinek czerwonych u chorego z wrodzoną niesferocytową niedokrwistością hemolityczną. Acta Haematol. Pol., 2005, 36, 343-354.

5.    Taviazzi D., Taher A., Cappellini M.D.: Red blood enzyme disorders: an overview. Pediatr. Ann., 2008, 37(5),  303-310.

6.    Glader B., Allen G., De Alarcón P.A., Werner E.J.: Neonatal Hematology. Cambridge University Press, 2005, 132-168.

7.    Miwa S., Fujii H.: Molecular basis of erythroenzymopathies associated with hereditary hemolytic anemia: tabulation of mutant enzymes. Am. J. Hematol., 1996, 51, 122-132.

8.    Jabłońska-Skwiecińska E, Rokicka-Milewska R.: Wyniki wieloletniej obserwacji dzieci z niedoborem dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej krwinek czerwonych. Pol. Tyg. Lek., 1988, XLIII, 18-19, 595-597.

9.    Jabłońska-Skwiecińska E., Lewandowska I., Płochocka D., Topczewski J., Zimowski J.G., Kłopocka J., Burzyńska B.: Several mutations including two novel mutations of the Glucose-6-Phosphate Dehydrogenase gene in Polish G6PD deficient subjects with Chronic Nonspherocytic Hemolytic Anemia and Favism. Human Mutation, 1999, 14, 477-484.

10.    Maciag M., Plochocka D., Jablonska-Skwiecinska E., Mendek-Czajkowska E., Golaszewska E., Strojny W., Balwierz W., Zdebska E., Burzynska B.: Molecular analysis of three novel G6PD variants: G6PD Pedoplis-Ckaro, G6PD Piotrkow and G6PD Krakow. Acta Biochim. Pol., 2007, 54(4), 877-881.

11.    Zarza R., Pujades A., Rovira A., Saavedra R., Fernandez J., Aymerich M., Vives Corrons J.L.: Two new mutations of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) gene associated with haemolytic anaemia: clinical, biochemical and molecular relationships. Br. J. Haematol., 1997, 98(3), 578-582.

..............................................................................................................................................................

Adres do korespondencji:

Beata Burzyńska
Zakład Genetyki, Instytut Biochemii
i Biofizyki PAN
ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa
tel. (0-22) 592-12-14
atka@ibb.waw.pl