*Praca była wykonana w ramach projektu badawczego zamawianego: nr PBZ-KBN-122/PO5/2004

WSTĘP

Dziedziczna stomatocytoza występuje w dwóch głównych postaciach: jako dziedziczna stomatocytoza uwodniona (DSU) i odwodniona (DSO) (1-3). Obie należą do chorób rzadkich. Odmianą DSU jest kriohydrocytoza. W postaci uwodnionej stomatocyty są najliczniejsze i charakteryzują się wyraźniej zaznaczonym centralnym przejaśnieniem, nie okrągłym, jak w prawidłowym erytrocycie, ale w formie szerokiej belki, kwadratu, półksiężyca albo łezki. Erytrocyty mają średnią objętość (MCV) powyżej 110 fL. Średnie stężenie hemoglobiny w krwince czerwonej (MCHC) jest zwykle obniżone, a zawartość hemoglobiny w krwince (MCH) podwyższona.

Pod względem innych objawów choroba przypomina łagodną sferozytozę i rzadko wymaga przetaczania krwi, ale może też wystąpić postać o cięższym przebiegu klinicznym. Wrażliwość krwinek na hemolizę osmotyczną jest wybitnie zwiększona, a odsetek retykulocytów znacznie podwyższony. W surowicy krwi obserwuje się zwiększenie poziomu bilirubiny i obniżenie stężenia haptoglobiny. W organizmie występuje, niezależna od transfuzji, hemochromatoza. Śledziona jest powiększona, w pęcherzyku żółciowym rozwija się kamica. Obok stomatocytozy najważniejszym objawem diagnostycznym choroby, który zarazem tłumaczy nadmierne uwodnienie krwinki, jest znaczne zwiększenie stężenia jonów sodu w jej wnętrzu. Ma to związek z podwyższoną przepuszczalnością błony krwinki czerwonej dla kationów, która zwiększa się 20-40x (2). Powoduje to wzrost aktywności tzw. ATP-zależnej pompy sodowo-potasowej w krwinkach czerwonych, co jednak nie wystarcza aby skompensować defekt przepuszczalności błony krwinki. Wzrost ten zwiększa zużycie energii w krwince czerwonej i nasila aktywne wchłanianie glukozy oraz glikolizę. Uważa się, że hydrocytozę krwinki czerwonej wywołuje przenikanie jonów sodu do krwinki czerwonej i związany z nim napływ wody do krwinki. Przyczyną choroby są, ostatnio odkryte, mutacje w obrębie genu białka – glikoproteiny towarzyszącej antygenom Rh (skrót angielski RhAG) (4). Białko to należy prawdopodobnie do rodziny białek zawiadujących przepływem amoniaku przez błonę krwinki czerwonej i tworzy w niej pory. Określone mutacje genu tego białka zmieniają jego funkcję w kanał wymiany kationów Na+ i K+. Natomiast kriohydrocytozę wywołują mutacje w obrębie genu wymieniacza anionów (białka prążka 3, skrót angielski AE1), które zmieniają jego funkcję również w kanał przepuszczający kationy (5). Razem białka RhAG i AE1 tworzą w błonie komórkowej krwinki kompleks zwany metabolonem wymiany gazowej (6). W kriohydrocytozie zwiększona przepuszczalność błony komórkowej dla kationów i związana z tym hemoliza występują przede wszystkim w temperaturze bliskiej 0° (7). Choroba ta występuje w dwóch odmianach I i II (3, 7). W obydwu krwinki czerwone wykazują znacznie zwiększoną przepuszczalność dla kationów w temperaturze bliskiej 0°. Stężenie hemoglobiny w świeżo pobranych krwinkach jest zwykle prawidłowe, ale spada wkrótce po wynaczynieniu, stąd nazwa kriohydrocytoza.

W typie II choroby występują objawy neurologiczne. We wszystkich wymienionych wyżej zespołach dziedziczenie jest zwykle dominujące. Innym objawem charakterystycznym dla DSU i kriohydrocytozy II jest znaczne obniżenie intensywności prążka 7 (stomatyny) w elektroforetogramie białek błony krwinki czerwonej (8). Obniżenie to potwierdzono immunologicznie przy użyciu przeciwciała anty-stomatyna. Nie wykryto jednak uszkodzenia genu stomatyny. Spadek poziomu stomatyny ma mieć związek ze wzrostem natężenia glikolizy.

W stomatocytozach i zespołach skojarzonych może wystąpić nadkrzepliwość krwi. Dlatego u chorych nie wolno wykonywać zabiegu splenektomii, bo skutkuje on powikłaniami zakrzepowo-zatorowymi (9). Charakterystycznymi objawami DSO (kserocytozy), które odróżniają tę chorobę od DSU, są: zmniejszona wrażliwość krwinek czerwonych na hemolizę osmotyczną i wzrost stężenia hemoglobiny wewnątrz krwinki.

OPIS PRZYPADKU

Chory, urodzony w roku 1977, od pierwszego roku życia wymagał hospitalizacji. Początkowo rozpoznano u niego niedokrwistość auto-hemolityczną, ale po roku rozpoznanie zmieniono na sferocytozę.  To rozpoznanie utrzymało się przez 26 lat. Podczas kolejnych hospitalizacji badano u chorego morfologię krwi, OB (było zawsze prawidłowe), bilirubinę całkowitą i pośrednią, które były miernie podwyższone oraz wrażliwość krwinek czerwonych na hemolizę osmotyczną, która była niezmiennie podwyższona. W teście nieinkubowanym zaczynała się już w roztworze 0,7% NaCl, a w teście inkubowanym, w badaniach wykonywanych podczas różnych hospitalizacji, od 0,75 do 0,85% NaCl. Poziom żelaza i transferryny oraz stężenie jonów sodu i potasu w surowicy krwi mieściły się w granicach wartości prawidłowych. Chory był leczony antybiotykami, kortykosteroidami, podawano mu kwas foliowy i witaminę B12. Z chwilą gdy w szpitalach pojawiły się analizatory hematologiczne morfologia była określana dokładniej, z pomiarem podstawowych parametrów krwinki czerwonej, w tym MCV, MCHC i MCH oraz retykulocytozy, która wahała w granicach od 5 do 20%. Obserwowano zwiększoną objętość krwinek czerwonych (110-120 fL) i obniżenie MCHC (rzędu 28 g/dL), jednak wartości te nie były w epikryzach komentowane. W maju 1988 r. wykonano u chorego splenektomię, która przebiegła początkowo bez powikłań, ale w r. 2000 – wg oświadczenia chorego – w „żyle powierzchniowej kończyny dolnej” pojawił sie zakrzep, który wyleczono przy pomocy terapii zachowawczej.

Zakrzep w tejże żyle pojawiał się jeszcze kilka razy i ostatecznie została ona wycięta. W latach 90-tych chory przeniósł się do Warszawy i tam, w roku 2005, w Instytucie Hematologii i Transfuzjologii wykluczono u niego rozpoznanie sferozytozy na podstawie podwyższonego (123,8% próbki kontrolnej), a nie obniżonego wyniku testu EMA. W Instytucie chory został poddany wielu specjalistycznym badaniom. Oznaczono u niego enzymy krwinki czerwonej (aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu, izomerazy glukozo-fosforanowej, kinazy pirogronianowej i heksokinazy). Z wyjątkiem heksokinazy aktywność innych oznaczanych enzymów była miernie podwyższona, w granicach od kilku do kilkunastu procent. Natomiast aktywność heksokinazy była podwyższona aż o 80%. Może to mieć związek z opisanym we wstępie sprzężeniem pomiędzy wzrostem aktywności pompy sodowej a glikolizą. Nieznacznie podwyższone były też aktywności aminotransferaz ALT i AST i czasu protrombinowego (INR odpowiednio 1,04 i 1,09), co sugeruje uszkodzenie wątroby pod wpływem składowanego w niej żelaza w następstwie narastającej hemochromatozy (patrz poziomy ferrytyny w tabeli I). Wyniki oznaczeń czasu kaolinowo-kefalinowego i poziomu fibrynogenu utrzymywały się w granicach wartości prawidłowych. Poziom haptoglobiny był zerowy. Wykonano badanie mikroskopowe szpiku, które wykazało przewagę układu czerwonokrwinkowego, a kariotyp, okazał się prawidłowy. Poziomy witaminy B12, kwasu foliowego i erytropoetyny były w granicach wartości prawidłowych. Inne wyniki są przedstawione w tabeli I.

Prążek 7 w elektroforetogramie białek błony erytrocyta, wykonanym metodą SDS-PAGE, był podwójny, ale nawet licząc tylko jeden z prążków, poziom stomatyny nie był obniżony. Rozpoznanie udało sie ustalić, gdy jeden z autorów niniejszej pracy zwrócił uwagę na współwystępowanie zwiększonej objętości krwinki czerwonej i niskiego stężenia hemoglobiny w krwince (tab. I). Wiadomo wprawdzie, że w niedokrwistościach hemolitycznych objętość krwinki może się zwiększyć przy obniżonym stężeniu hemoglobiny wewnątrz krwinki, ale nie do tego stopnia co w opisywanym przypadku. Krwinki o takich właściwościach są natomiast typowe dla DSU. Zainteresowano się więc wynikami badania rozmazów krwi z czasów poprzednich hospitalizacji chorego. Nie znaleziono ich jednak w żadnej z epikryz. Obejrzano zachowane rozmazy krwi chorego z roku 2005 i stwierdzono w nich stomatocyty, a raczej stomatosferocyty (ryc. 1 – umieszczona między stronami 132-133), bo poprzeczna belka (stoma) była w niektórych erytrocytach wąska, w innych przybierała formę trójkąta lub pojedynczego niewielkiego wklęśnięcia (10). W międzyczasie chory wyjechał na stałe do Anglii. W czasie kilkudniowego jego pobytu w Polsce w sierpniu 2008 r. zbadano raz jeszcze krew i wykonano oznaczenia Na+ i K+ w krwinkach czerwonych. Tym razem w rozmazie krwi pacjenta były widoczne tylko makrocyty, przypominające sferocyty, nieliczne krwinki tarczowate i stomatocyty (razem ok. 4%), a w barwieniu przyżyciowym nieliczne stomatosferocyty (ryc. 1 – umieszczona między stronami 132-133).

Zgodnie z oczekiwaniem stwierdzono w krwinkach czerwonych znacznie zwiększoną zawartość Na+ i obniżony poziom K+ (tab. I). Jony te oznaczono metodą pomiaru emisji w atomowym spektrometrze płomieniowym.

Jak wiadomo, w stomatocytozach i chorobach skojarzonych występują różne wielkości biernych przepływów Na+ i K+ krwinek czerwonych do osocza i odwrotnie. Przepływy te można mierzyć w warunkach zahamowania pompy sodowo-potasowej oraz ko-transportera jonów Na+, K+, 2Cl- przy pomocy odpowiednio quabainy i bumetanidu (2). Wielkości biernego przepływu wykorzystuje się m.in. do różnicowania wariantów tych chorób. W kriohydrocytozie przepływy jonów są największe w temperaturze 0°, co jest przyczyną hemolizy (11). W niniejszej pracy, celem wykluczenia kriohydrocytozy, inkubowano heparynizowaną krew pełną chorego w temperaturze 0° przez 24 h. Hemoliza po inkubacji była rzędu 2%. Na tej podstawie wykluczono kriohydrocytozę. Rozpoznanie stomatocytozy u ojca pozwoliło rozpoznać tę chorobę również u syna, urodzonego 12 X 2005 r. już z objawami niedokrwistości. W 12-ym dniu po urodzeniu przetoczono mu krew ze względu na małą liczbę erytrocytów we krwi (2,96x1012/L) i niski poziom hemoglobiny (8,6 g d/L). Morfologia z kwietnia 2006 r. ujawniła podobne parametry erytrocytów co u ojca: MCV 106,3 fL, MCH 31,5 pg/krwinkę i MCHC 29,7 g/dL. W rozmazie były widoczne pojedyncze stomatocyty i krwinki tarczowate. Wiązanie barwnika EMA do erytrocytów było podwyższone (1205,4% próbki kontrolnej), a aktywność heksokinazy w krwinkach była dwukrotnie zwiększona.

Opis choroby u syna będzie przedmiotem oddzielnego doniesienia, bo dziecko przebywa w tej chwili za granicą i nie można u niego wykonać stosownych badań, m.in. oznaczenia stężeń jonów Na+ i K+ w krwinkach czerwonych.

DYSKUSJA

Rozpoznanie uwodnionej postaci stomatocytozy ustalono na podstawie współistnienia u chorego z łagodną makrocytową niedokrwistością hemolityczną obniżonego stężenia hemoglobiny w krwinkach czerwonych, wybitnie zwiększonej wrażliwości krwinek czerwonych na hemolizę osmotyczną, przy wzroście (a nie spadku) wiązania barwnika EMA oraz obecności bardzo wysokiego poziomu Na+ i niskiego poziomu K+ wewnątrz erytrocytów. Krwinki czerwone nie hemolizowały po inkubacji w temperaturze 0°  przez 24 h. We krwi chorego stwierdzono obecność stomatosferocytów oraz sferocytów, ale w następnym badaniu, wykonanym trzy lata później, znaleziono przede wszystkim duże krwinki czerwone o słabo zaznaczonym centralnym przejaśnieniu, przypominające sferocyty.  Można więc przypuszczać, że stomatosferocyty we krwi chorego albo ulegają w krążeniu normalizacji kształtu, co byłoby zgodne z nieznaczną tym razem retykulocytozą (tab. I), względnie transformacji do sferocytów. Należy jednak pamiętać, że stomatocyty w DSU są często trudne do wykrycia. Transformację prawidłowych krwinek czerwonych do sferocytów, poprzez stadium stomatosferocytów, obserwowano pod wpływem dwuestru phorbolu (PMA) (10) lub chloropromazyny (12). Efekt był w obu przypadkach zależny od dawki. Postulowano, że jest on wynikiem „endo-vesykulacji” błony komórkowej erytrocyta. Możliwość takiej transformacji należy jeszcze potwierdzić, gdy chory zjawi się ponownie w kraju. Podobnie, należałoby sprawdzić raz jeszcze poziom stomatyny w błonie krwinek czerwonych metodą „western blotting”, przy użyciu swoistego przeciwciała anty-stomatyna. Gdyby wyniki się powtórzyły, to opisany przypadek stanowiłby nowy podtyp DSU. Za ewentualnością nowego podtypu przemawia stosunkowo mała liczba stomatocytów we krwi pacjenta. Trzeba odnotować, że wspomniany wyżej wzrost wiązania barwnika EMA do krwinek czerwonych u chorych na DSU, przy zwiększonej wrażliwości krwinek na hemolizę osmotyczną, nie został dotąd opisany. Wzrost wiązania EMA do krwinek czerwonych u pojedynczego chorego na DSU był jednak zn
any dr May-Jean King z International Blood Group Reference Laboratory, Bristol, UK (infomacja osobista).

Interesująca jest własna obserwacja chorego, że sport i ogólnie wysiłek fizyczny poprawiały jego samopoczucie. Natomiast stresy o charakterze psychicznym (np. przed egzaminami w czasie studiów) powodowały nasilenia choroby i podnosiły poziom bilirubiny, który chory oceniał sam na podstawie stopnia zażółcenia białek oczu. Sugeruje to wpływ stanu psychicznego chorego być może na morfologię erytrocytów. Wiadomo, że stomatocyty pojawiają się w krwi osób po ciężkich urazach (13).

Należy wspomnieć o wcześniejszym przypadku stomatocytozy w Polsce, rozpoznanego wyłącznie na podstawie wystąpienia u chorego dziedzicznej niedokrwistości hemolitycznej i obecności stomatocytów we krwi w liczbie 16-36% (14). Nie wiadomo jaki był to wariant choroby, bo w pracy brak jest informacji na temat wrażliwości krwinek czerwonych na hemolizę osmotyczną i wewnątrzkomórkowego stężenia jonów sodu i potasu. Ze względu na wysoką liczbę stomatocytów we krwi był to prawdopodobnie przypadek DSU.

WNIOSKI

Pomimo swojej rzadkości, dziedziczna stomatocytoza i choroby pokrewne powinny być uwzględniane w diagnostyce różnicowej niedokrwistości hemolitycznej, w tym u noworodków. Pomocne w rozpoznaniu choroby jest ustalenie wzrostu wiązania barwnika EMA przez krwinki czerwone pacjentów, przy podwyższonej wrażliwości krwinek na hemolizę osmotyczną. Nieobecność większej liczby stomatocytów we krwi nie wyklucza rozpoznania DSU.

..............................................................................................................................................................

Podziękowanie

Autorzy pragną podziękować pp. dr hab. Pawłowi Włodarskiemu oraz dr Ryszardowi Galusowi z Katedry Histologii i Embriologii Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego za wykonanie zdjęć mikroskopowych.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Gallagher P.G.: Acanthocytosis, stomatocytosis, & related disorders. Williams Hematology, McGraw-Hill, New York i inne miasta., 2001, 519-526.

2.    Stewart G.W.: Hemolytic disease due to membrane ion channel disorders. Curr. Opin. Hematol., 2004, 11, 244-250.

3.    Delaunay J.: The Hereditary Stomatocytoses. Genetic disorders of the red cell membrane permeability to monovalent cations. Semin. Hematol., 2004, 41, 165-172.

4.    Bruce L.J., Guizouarn H., Burton N.M. i wsp.: The monovalent cation leak in over-hydrated stomatocytic red blood cells results from amino acid substitutions in the Rh associated glycoprotein (RhAG). Blood, 2009, 113, 1350-1357.

5.    Bruce L.J., Robinson H.C., Guizouarn H: i wsp.: Monovalent cation leaks in human red cells caused by single amino-acid substitutions in the transport domain of the band 3 chloride-bicarbonate exchanger, AE1. Nat. Genet., 2005, 37, 1258-1263.

6.    Bruce L.J., Beckmann R., Ribeiro M.L. i wsp.: A band 3-based macrocomplex of integral and peripheral proteins in the RBC membrane. Blood, 2003, 101, 4180-4188.

7.    Fricke B., Jarvis H.G., Reid C.D. i wsp.: Four new cases of stomatin-deficient hereditary stomatocytosis syndrome: classification of the stomatin-deficient cryohydrocytosis variant with neurological dysfunction. Br. J. Haematol., 2004, 125, 796-803.

8.    Fricke B., Argent A.C., Chetty M.C. i wsp.: The “stomatin” gene and protein in overhydrated stomatocytosis. Blood, 2003, 102, 2268-2277.

9.    Stewart G.W., Amess J.A.L., Eber S.W. i wsp.: Thrombo-embolic disease after splenectomy for hereditary stomatocytosis. Br. J. Haematol., 1996, 93, 303-310.

10.    White J.G., Repine J.: Fine structural alterations induced in erythrocytes by phorbol myristate acetate. Am. J. Pathol., 1978, 91, 571-580.

11.    Jarvis H.G., Gore D.M, Briggs C. i wsp.: Cold storage of “cryohydrocytosis” red cells: the osmotic susceptibility of the cold-stored erythrocyte. Br. J. Haematol., 2003, 122, 859-868.

12.    Reinhart W.H., Chien S.: Red cell rheology in stomatocyte-echinocyte transformation: roles of cell geometry and cell shape. Blood, 1986, 67, 110-118.

13.    Berezina T.L, Zaets S.B., Machiedo G.W.: Alterations of red blood cell shape in patients with severe trauma. J. Trauma, 2004, 57, 82-87.

14.    Domagała J.: Stomatocytoza wrodzona. Ped. Pol., 1987, 62,
11-12.

..............................................................................................................................................................

Adres do korespondencji:

Jerzy Kościelak
ul. Rajska 1 m 68, 02-654 Warszawa
tel. (0-22) 49-310-51
jkoscielak@ihit.waw.pl