*Praca finansowana z grantu nr PBZ-KBN-122/P05/2004 Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego

1. WSTĘP

Zespół Angelmana (AS) jest chorobą neurogenetyczną, w której obserwuje się zaburzenie rodzicielskiego piętna genomowego, najczęściej wskutek rozległych delecji lub jednorodzicielskiej ojcowskiej disomii chromosomu 15 (1-3). W około 0,5% przypadków AS za defekt imprintingowy odpowiedzialne są mutacje regulatorowe o charakterze mikrodelecji w obrębie centrum piętnowania genomowego (IC) w regionie 15q11-13 na chromosomie pochodzenia matczynego (4-9). Zmiana ta prowadzi do utraty aktywnego obszaru regulatorowego AS-SRO, a w konsekwencji braku ekspresji genów UBE3A i ATP10C (10-12). U niewielkiej liczby pacjentów stwierdza się mozaicyzm somatyczny defektu imprintingowego, gdzie nieprawidłowe komórki mogą stanowić od 40% do 90% komórek krwi (5, 13).

Do niedawna przypadki defektu IC z mikrodelecją oraz mozaikowatość somatyczna stanowiły duży problem diagnostyczny (14). W chwili obecnej dla potwierdzenia obu tych defektów molekularnych można wykorzystać technikę ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-qPCR; ang. Real-Time quantitative PCR). Polega ona na ilościowej ocenie produktu amplifikacji, a tym samym pozwala na określenie liczby kopii badanego regionu w odniesieniu do genu referencyjnego (analiza mikrodelecji) czy udziału sekwencji metylowanych w badanym materiale (analiza mozaikowatości) (13, 15, 16).

Celem pracy było opracowanie optymalnych warunków do diagnostyki molekularnej tych rzadkich defektów występujących u dzieci z rozpoznaniem AS z wykorzystaniem techniki ilościowego PCR w czasie rzeczywistym i próba ich identyfikacji u wyselekcjonowanych pacjentów AS.

2. MATERIAŁ I METODY

Do badań molekularnych wykorzystano preparaty DNA chromosomalnego otrzymane z krwi obwodowej od 205 chorych z rozpoznaniem klinicznym AS ustalonym na podstawie oceny klinicznej i wywiadu rodzinnego. Pacjenci objęci są opieką Poradni Genetycznej Zakładu Genetyki Medycznej Instytutu Matki i Dziecka w Warszawie lub innych ośrodków medycznych na terenie Polski, pozostających we współpracy z Instytutem Matki i Dziecka. Rodziny badanych lub ich prawni opiekunowie zostali zapoznani z celami badania i wyrazili zgodę na ich wykonywanie.

2.1. Kwalifikacja pacjentów do badań

Ustalanie wzoru metylacji DNA było wstępnym etapem badań molekularnych, umożliwiającym weryfikację rozpoznania klinicznego i kwalifikację pacjentów do dalszych analiz (tab. I, ryc.3). Pacjenci, w liczbie 145, u których stwierdzono prawidłowy wzór metylacji w loci SNRPN i D15S63 zostali wyłączeni z badań będących przedmiotem niniejszej pracy. Do dalszych badań włączono jedynie osoby z zaburzonym wzorem metylacji (ryc. 4).

2.2. Analiza metylacji DNA

Analiza wzoru metylacji DNA umożliwia określenie rodzicielskiego pochodzenia badanego regionu DNA. W badaniu tym wykorzystuje się fakt specyficznej metylacji w regionie q11-q13 chromosomu 15 pochodzenia matczynego. Analizę wzoru metylacji przeprowadzono dla dwóch loci SNRPN i D15S63 (PW71) zlokalizowanych w obrębie badanego regionu chromosomowego.

Badanie metylacji DNA przeprowadzane jest za pomocą techniki MS-PCR (ang. Methylation Specific Polymerase Chain Reaction) z wykorzystaniem starterów specyficznych dla kopii metylowanej (matczynej) i niemetylowanej (ojcowskiej; tab. II1, ryc. 3) (17, 18), zaś matrycę do reakcji stanowi DNA zmodyfikowane kwaśnym dwusiarczynem sodu. Procedurę modyfikacji, w wyniku której niemetylowana cytozyna podlega przekształceniu w uracyl, przeprowadzono z zastosowaniem CpGenome™ DNA Modification Kit, zgodnie z zaleceniami producenta (Intergen).

2.3. Identyfikacja mikrodelecji w IC

Do identyfikacji mikrodelecji w obrębie centrum imprintingowego wykorzystano technikę powielania DNA pozwalającą na ilościową ocenę produktu reakcji w czasie rzeczywistym. W analizie mikrodelecyjnej porównywano sygnał amplifikacji badanego locus – sekwencji znajdującej się w regionie mikrodelecyjnym (AS-SRO) do sygnału amplifikacji kontroli wewnętrznej – genu występującego w genomie w dwóch kopiach (HBB, β-globina). Amplifikacja i ilościowa ocena produktów odpowiadających sekwencji AS-SRO i β-globiny odbywa się w jednej próbówce z wykorzystaniem systemu sond hybrydyzujących LightCycler® znakowanych różnymi fluorochromami (tab. II) (16).

Do normalizacji wyników w obrębie eksperymentu i pomiędzy oddzielnymi reakcjami zastosowano kalibrator – próbkę o stałym stosunku liczby kopii badanego locus do liczby kopii kontroli wewnętrznej. Do identyfikacji mikrodelecji w obrębie IC, obok wybranego kalibratora, używano także standardy (próbki o znanym stężeniu DNA, rozcieńczone w zakresie od 100 do 10-4), kontrolę negatywną i kontrolne DNA (7 pacjentów AS z dużymi delecjami). Reakcje amplifikacji i detekcję fluorescencji prowadzono w aparacie LightCycler® 2.0.

System LightCycler 2.0 umożliwia jednoczesne wykrywanie i analizę do 6 różnych fluorochromów w pojedynczej kapilarze. Z powodu zachodzenia na siebie widm emisji różnych barwników fluorescencyjnych i przenikania sygnału fluorescencyjnego mogą powstawać błędne wyniki. Celem ich skorygowania przeprowadzono kompensację koloru, wykorzystując moduł Color Compensation programu LightCycler Software 4.05.

Podstawowym parametrem ocenianym w technice ilościowego PCR w czasie rzeczywistym jest wartość CP (ang. Crossing Point, punkt przecięcia) lub CT (ang. Threshold Cycle, cykl progowy) – cykl, w którym fluorescencja przekracza sygnał tła i reakcja wchodzi w fazę wzrostu logarytmicznego, gdzie liczba powstałych w tym okresie cząstek jest wprost proporcjonalna do wyjściowej ilości matrycy. Im więcej jest kopii badanej sekwencji w momencie rozpoczęcia reakcji, tym mniej cykli potrzeba, aby poziom fluorescencji pochodzący z powstających produktów przekroczył wartość CT (15).

Identyfikacja mikrodelecji w obrębie centrum imprintingowego jest względną analizą ilościową. Do oceny dawki AS-SRO wykorzystano model matematyczny opracowany przez Roche Diagnostic (19), oparty na porównaniu wydajności amplifikacji i wartości CT dla locus badanego i kontroli wewnętrznej. Dla celów porównawczych oceny dawki AS-SRO zastosowano również dwa inne modele matematyczne: oparty o krzywe standardowe model określający względny stosunek ekspresji (R) badanego locus do kontroli wewnętrznej oraz metodę ΔΔCT (20) opartą na podwójnej normalizacji przy użyciu kontroli wewnętrznej (β-globiny) i kalibratora (próbki bez mikrodelecji).

2.4. Analiza mozaikowatości defektów imprintingowych

W celu ustalenia odsetka komórek prawidłowych i z defektem imprintingowym zastosowano analizę ilościowego PCR dla sekwencji metylowanych (QAMA; ang. Quantitative Analysis of Methylated Alleles) (13). Metoda ta oparta jest na amplifikacji fragmentu promotora i eksonu 1 locus SNURF-SNRPN (region podlega piętnowaniu genomowemu) na matrycy zmodyfikowanej dwusiarczynem sodu (por. 2.2). W celu uzyskania takiej samej wydajności powielania sekwencji metylowanej i niemetylowanej, startery do reakcji są komplementarne do sekwencji nie zawierających dwunukleotydów CG. Odróżnienie allelu metylowanego od niemetylowanego umożliwia zastosowanie sond TaqMan® MGB wyznakowanych barwnikami fluorescencyjnymi: FAM (allel metylowany) i NED (allel niemetylowany). Poza próbkami badanymi, do każdej analizy włączano próbki z krzywej standardowej (por. niżej) oraz kontrole: negatywną (brak DNA) i pozytywną (DNA osoby zdrowej). Wszystkie próbki amplifikowane były w dwóch powtórzeniach.

Dla dokładnego określenia proporcji metylowanych do niemetylowanych alleli zastosowano metodę ΔCp (21). Wyniki uzyskane dla poszczególnych pacjentów odnoszono do odpowiedniej krzywej standardowej.

W celu określenia relatywnej ilości alleli metylowanych stworzono krzywą standardową mieszając różne ilości DNA pacjenta z zespołem Pradera-Williego z ojcowską delecją regionu 15q11-q13 (jedna kopia metylowana), z DNA pacjenta z AS z matczyną delecją tego samego regionu (jedna kopia niemetylowana). Stosunek stężeń (r) dwóch frakcji DNA (metylowanej i niemetylowanej) możemy określić równaniem: (patrz Ryc. 1.)

Podstawiając odpowiednie wartości (c=c0, a=ln(d0)-ln(d1), ΔCp=ln(r), ΔCp=CpNED – CpFAM), logarytmując obie strony równania i przekształcając wzór ostatecznie otrzymujemy: (patrz Ryc. 2.)

Po uzyskaniu wyników dla standardów, stworzono krzywą obrazującą zależność wartości ΔCp od procentowego udziału sekwencji metylowanych w poszczególnych próbkach referencyjnych. Dopasowanie krzywej powyższego równania do punktów doświadczalnych i określenie wartości parametrów a i b przeprowadzono w matematycznym programie komputerowym Mathematica 5.0 (Wolfram Research, Inc). Stosunek alleli metylowanych do niemetylowanych dla próbek badanych, oraz ustalenie odsetka komórek prawidłowych i z defektem imprintingowym wykonano w arkuszu kalkulacyjnym Microsoft Excel.

3. WYNIKI

3.1. Identyfikacja mikrodelecji w IC

W pierwszym etapie analizą mikrodelecji w centrum imprintingowym przy użyciu techniki Real-Time qPCR objęto grupę pilotażową składającą się z 23 osób: 7 chorych AS z delecją regionu 15 q11-q13 obejmującej region IC oraz 16 osób zdrowych. W badanym materiale klinicznym nie dysponowano próbkami od chorego ze zidentyfikowaną mikrodelecją w IC, które mogłyby stanowić kontrolę pozytywną przeprowadzanego eksperymentu.

Otrzymane wartości Cp, oraz krzywe amplifikacji dla AS-SRO i β-globiny u zdrowych osób były zbliżone (ryc. 5A). U chorych AS z dużą delecją wartości Cp dla AS-SRO były większe średnio o 0,51 w porównaniu z wartością dla β-globiny (ryc. 5B). W sześciu przypadkach stwierdzono dwukrotne zmniejszenie amplifikacji locus AS-SRO względem β-globiny, świadczące o występowaniu delecji.

U pacjenta o numerze 2158 analiza mikrodelecji w IC nie potwierdziła obecności delecji w badanym regionie. Wcześniejsze badania wykonane u chorego metodą hybrydyzacji genomowej z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych wrażliwych na metylację (sondy SmN1 i PW71B, KB17) oraz techniką MS-PCR dawały wyniki pozytywne, wskazujące na występowanie delecji obejmującej przynajmniej region od locus D15S63 do SNRPN. Analiza ilościowa wykazała obecność obu loci AS-SRO w genomie pacjenta (tab. III), co stanowiło podstawę do weryfikacji wcześniejszych wyników. W grupie 7 badanych chorych z zespołem Angelmana, zakwalifikowanych do analizy mikrodelecji w IC, w żadnym przypadku nie wykryto poszukiwanej mutacji.

Do obliczenia dawki AS-SRO zastosowano 3 różne modele matematyczne (por. rozdz. 2.3), które dały zbliżone wyniki. Średnie wartości współczynnika R i jego 95% przedziały ufności, wyliczone dla każdej z metod, nie pokrywały się i były wyraźnie rozdzielone pomiędzy osobami zdrowymi a chorymi z dużą delecją, co umożliwiło określenie dawki locus AS-SRO we wszystkich badanych przypadkach.

3.2. Analiza mozaikowatości defektów imprintingowych

Analizę mozaikowatości somatycznej defektów imprintingowych metodą QAMA przeprowadzono u 33 osób, w tym u 28 chorych, u których w badaniu metylacji w locus SNRPN i D15S36 stwierdzono zaburzony wzór metylacji DNA. Ze względu na fakt, że dysponowano jedynie sondami dla locus SNRPN, osoby z zaburzonym wzorem metylacji w locus D15S63 przebadano przy użyciu tych sond jedynie kontrolnie. W eksperymencie wykorzystano próbki referencyjne – DNA 4 pacjentów z rozpoznaną mozaikowatością ID2, oraz kontrolne DNA osoby zdrowej.

Do wyznaczania krzywych standardowych, na podstawie których oszacowano stosunek alleli metylowanych do niemetylowanych w próbkach referencyjnych, użyto 5 próbek o różnym udziale procentowym metylowanego DNA (1,96%; 5,66%, 16,67%; 28,6% i 50%). Średnie wartości parametrów a i b, określone przy pomocy matematycznego programu komputerowego Mathematica 5.0 (Wolfram Research, Inc.) wynosiły odpowiednio: -0,047±0,166 i 0,746±0,097. Współczynnik R2 dla krzywych był większy od 0,96, co świadczyło o bardzo dobrym dopasowaniu krzywej do uzyskanych danych doświadczalnych.

Analiza ilościowego PCR dla sekwencji metylowanych nie wykazała mozaikowatości somatycznej defektu imprintingowego u żadnego z 28 chorych AS z zaburzonym wzorem metylacji w loci SNRPN i D15S63. Stopień metylacji DNA wahał się od 0% do 55% (tab. IV). W 9 przypadkach nie zaobserwowano wzrostu fluorescencji dla znacznika VIC, co wskazuje na całkowity brak u tych osób alleli metylowanych i sugeruje występowanie dużej delecji, UPD, lub mikrodelecji w IC. U pozostałych chorych procentowy udział metylowanego DNA w badanym materiale genetycznym stanowił średnio 48,7%. Powtórna analiza metylacji DNA w locus SNRPN z wykorzystaniem MS-PCR potwierdziła w 96% wyniki badania metodą QAMA. Jedynie u pacjenta z numerem 4385 nadal obserwowano zaburzony wzór metylacji DNA. Analiza ilościowa wykazała jednak równy stosunek alleli metylowanych do niemetylowanych, co świadczy o występowaniu obu rodzicielskich kopii badanego regionu.

Wyniki uzyskane dla metody QAMA porównano z wynikami wcześniejszych badań prowadzonych innymi metodami. Umożliwiło to potwierdzenie defektu molekularnego w 5 przypadkach. Chorzy podejrzani o delecję, UPD, lub mikrodelecję w IC wymagają przeprowadzenia kolejnych badań w celu ustalenia podłoża molekularnego choroby.

DYSKUSJA

Defekt piętna genomowego wynikający z obecności mikrodelecji w IC i mozaikowatość somatyczna defektu imprintingowego są rzadko spotykanymi u pacjentów z AS defektami molekularnymi, których obecność można w chwili obecnej wykazać z wykorzystaniem techniki ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (6). Pozwala ona na bardziej precyzyjną, ilościową ocenę liczby kopii badanego regionu czy udziału sekwencji metylowanych w analizowanych próbkach (13, 16).

Przewaga techniki ilościowego PCR w czasie rzeczywistym nad tradycyjną reakcją amplifikacji jest szczególnie wyraźna w przypadku analizy mozaikowatości u pacjentów z zaburzonym wzorem metylacji. Okazało się, że stosowana rutynowo metoda MS-PCR może w pewnych przypadkach dawać wyniki fałszywie pozytywne (14). W badanej grupie 205 pacjentów, zaburzony wzór metylacji w locus SNRPN i D15S36 stwierdzono w 28 przypadkach. Ponowna analiza tego samego materiału z wykorzystaniem metody QAMA opartej na technice ilościowego PCR nie potwierdziła uzyskanych wcześniej wyników – wśród badanych pacjentów nie udało się zidentyfikować chorego z mozaikowatością defektu imprintingowego. Zaburzony wzór metylacji DNA w locus SNRPN czy D15S36 uzyskany za pomocą techniki MS-PCR może więc stanowić wynik fałszywie pozytywny. Zastosowanie analizy ilościowej PCR dla sekwencji metylowanych umożliwia w takiej sytuacji weryfikację rozpoznania i ustalenie poprawnego wzoru metylacji we wszystkich wątpliwych przypadkach (13).

Mimo, że metoda QAMA jest doskonałym narzędziem do badania mozaikowatości defektu imprintingowego, należy brać pod uwagę jej ograniczenia. Obecność polimorfizmu/mutacji czy niepełnej metylacji wysp CpG w miejscu wiązania sond molekularnych może wpływać na interpretację wyników (21, 22). Również zbyt mała liczba komórek z defektem imprintingowym w badanym materiale, najczęściej krwi, może spowodować, że wynik badania będzie fałszywie negatywny. Pewnym rozwiązaniem problemu byłaby analiza metylacji w innych tkankach np. fibroblastach, jednakże uzyskany wynik w dalszym ciągu nie obrazowałby zmian molekularnych obecnych w mózgu (13).

Technika ilościowego PCR w czasie rzeczywistym została także wykorzystana do oceny mikrodelecji w obrębie centrum regulatorowego AS-SRO z wykorzystaniem genu kodującego β-globinę jako gen referencyjny (16). U osób zdrowych względny stosunek liczby kopii AS-SRO do β-globiny zbliżony był do wartości 1, zaś u osób z dużą delecją, użytych jako próbki kontrolne, bliski 0,5. W prezentowanej pracy porównano także trzy modele matematyczne pozwalające na ocenę dawki AS-SRO przy użyciu techniki ilościowego PCR, jednakże nie stwierdzono znaczących różnic w średnich wartościach współczynnika R otrzymanych dla każdej metody, zaś wyniki otrzymane dla AS-SRO były zbliżone (por. tab. III).

Niewątpliwie istotny wpływ na dokładność otrzymanych wyników w technice ilościowego PCR ma czystość i jakość stosowanego DNA, dlatego stosunek A260/A280 informujący o czystości analizowanej próbki powinien wynosić 1,6-1,8. Ponadto przy stosowaniu metod opartych na krzywej standardowej należy zwrócić szczególną uwagę na dokładne określenie stężenia DNA próbki wyjściowej, używanej jako standard i jej dokładne rozcieńczenie. Zgodnie z wymogami statystycznymi krzywa standardowa powinna zawierać przynajmniej trzy punkty o rożnym stężeniu, a każdy punkt powinien być nakładany przynajmniej w dwóch powtórzeniach. Krzywa standardowa musi się charakteryzować także bardzo dobrym dopasowaniem do danych doświadczalnych (r2>0,99; lub Error <0,2). Z badań wynika, że do identyfikacji mikrodelecji w IC powinno się stosować standardy od 100 do 103 (400-0,4 ng) gdyż mieszczą się w zakresie dynamicznym dla minimalnego i maksymalnego stężenia matrycy DNA, dla którego otrzymano precyzyjne wyniki.

Technika ilościowego PCR w czasie rzeczywistym jest potężnym narzędziem analitycznym w ilościowym oznaczaniu kwasów nukleinowych. Dzięki swej powtarzalności, dokładności, specyficzności, czułości oraz w powiązaniu z szeroką możliwością zastosowania, metoda ta powoli staje się „złotym standardem” w diagnostyce wielu chorób. Analiza mikrodelecji w IC oraz analiza mozaikowatości somatycznej defektów imprintingowych przy użyciu technik ilościowego PCR w czasie rzeczywistym mogą z powodzeniem być stosowane w rutynowej diagnostyce zespołu Angelmana (13, 23).

..............................................................................................................................................................

1Dokładne warunki reakcji (stężenia starterów i sond, temperatura przyłączania starterów itp.) dla reakcji prowadzonych z wykorzystaniem techniki PCR i Real-Time qPCR dostępne są u autorów pracy.

2Dzięki uprzejmości Dr. Karin Buiting, Institute for Human Genetics, Universitatsklinikum Essen, Niemcy.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Clayton-Smith J., Laan J.: Angelman syndrome: a review of the clinical and genetic aspects. J. Med. Genet., 2003, 49, 87-95.

2.    Williams C.A., Angelman H., Clayton-Smith J. i wsp.: Angelman syndrome: consensus for diagnostic criteria.Angelman Syndrome Foundation. Am. J. Med. Genet., 1995, 56, 237-238.

3.    Williams C.A., Beaudet A.L., Clayton-Smith J. i wsp.: Angelman syndrome 2005: updated consensus for diagnostic criteria. Am. J. Med. Genet., 2006, 140A, 413-418.

4.    Jiang Y., Lev-Lehman E., Bressler J., Tsai TF., Beaudet A.L.: Genetics of Angelman syndrome. Am. J. Hum. Genet., 1999, 65, 1-6.

5.    Szpecht-Potocka A., Gos M., Struniawski R. i wsp.: Zespół Angelmana – model badawczy epigenetycznych mechanizmów regulacji ekspresji genów. Med. Wieku Rozwoj., 2009, XIII, 2, 123-130.

6.    Buiting K., Gross S., Lich C. i wsp.: Epimutations in Prader-Willi and Angelman syndromes: a molecular study of 136 patients with an imprinting defect. Am. J. Hum. Genet., 2003, 72, 571-577.

7.    Horsthemke B., Dittrich B., Buiting K.: Imprinting mutations on human chromosome 15. Hum. Mutat. 1997, 10, 329-337.

8.    Saitoh S., Buiting K., Rogan PK. i wsp.: Minimal definition of the imprinting center and fixation of chromosome 15q11-q13 epigenotype by imprinting mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 7811-7815.

9.    Buiting K., Lich C., Cottrell S. i wsp.: A 5-kb imprinting center deletion in a family with Angelman syndrome reduces the shortest region of deletion overlap to 880 bp. Hum. Genet., 1999, 105, 665-666.

10.    Lalande M., Calciano M.A.: Molecular epigenetics of Angelman syndrome. Cell Mol. Life Sci., 2007, 64, 947-960.

11.    Meguro M., Kashiwagi A., Mitsuya K. i wsp.: A novel maternally expressed gene, ATP10C, encodes a putative aminophospholipid translocase associated with Angelman syndrome. Nat. Genet., 2001, 28, 19-20.

12.    Albrecht U., Sutcliffe J.S., Cattanach B.M. i wsp.: Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nat. Genet., 1997, 17, 75-78.

13.    Nazlican H., Zeschnigk M., Claussen U. i wsp.: Somatic mosaicism in patients with Angelman syndrome and an imprinting defect. Hum. Mol. Genet., 2004, 13, 2547-2555.

14.    Horsthemke B., Lich C., Buiting K. i wsp.: Problems in detecting mosaic DNA methylation in Angelman syndrome. Eur. J. Hum. Genet., 2003, 11, 913-915.

15.    Kubista M., Andrade J.M., Bengsson M. i wsp.: The real-time polymerase chain reaction. Mol. Aspects Med., 2006, 27, 95-125.

16.    Raca G., Buiting K., Das S.: Deletion analysis of the imprinting center region in patients with Angelman syndrome and Prader-Willi syndrome by real-time quantitative PCR. Genet. Test., 2004, 8, 387-394.

17.    Zeschnigk M., Lich C., Buiting K. i wsp.: A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur. J. Hum. Genet., 1997, 5, 94-98.

18.    Runte M., Faber C., Lich C. i wsp.: Comprehensive methylation analysis in typical and atypical PWS and AS patients with normal biparental chromosomes 15, Eur. J. Hum. Genet., 2001b, 9, 519-526.

19.    Soong R., Ruschoff J., Tabiti K.: Detection of colorectal micrometastasis by quantitative RT-PCR of cytokeratin 20 mRNA. Roche Molecular Biochemical Internal Publication 2000

20.    Livak K.J., Schmittgen T.D.: Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-ΔΔCT) method. Methods, 2001, 25, 402-408.

21.    Zeschnigk M., Bohringer S., Price E.A. i wsp.: A novel real-time PCR assay for quantitative analysis of methylated alleles (QAMA): analysis of the retinoblastoma locus. Nucleic Acids Res., 2004, 32, e125.

22.    Sulewska A., Niklińska W., Kozłowski M. i wsp.: Detection of DNA methylation in eucaryotic cells. Folia Histochem Cytobiol. 2007, 45, 315-324.

23.    Camprubi C., Dolors-Coll M., Villatoro S. i wsp.: Imprinting center analysis in Prader-Willi and Angelman syndrome patients with typical and atypical phenotypes. Eur. J. Med. Genet., 2007, 50, 11-20.

..............................................................................................................................................................

Adres do korespondencji:

Agnieszka Szpecht-Potocka
Zakład Genetyki Medycznej
Instytut Matki i Dziecka
ul. Kasprzaka 17a, 01-211 Warszawa
aspotocka@o2.pl