*Praca finansowana z grantu nr PBZ-KBN-122/PO5/2004 Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego

WSTĘP

Niepełnosprawność intelektualna (NI, ang. mental retardation, MR) dotyczy 2-3% populacji krajów rozwiniętych (1). NI jest najczęstszym powodem kierowania dzieci do klinik pediatrycznych i neurologicznych. Pacjenci z NI stanowią również większość w poradniach genetycznych, ze względu na ograniczone możliwości diagnostyczne w zakresie ustalenia przyczyn upośledzenia, ponad połowa z nich nie uzyskuje kompletnej porady genetycznej.

Identyfikacja genów warunkujących występowanie niespecyficznej NI sprzężonej z chromosomem X (MRX) jest przedsięwzięciem o ogromnym znaczeniu z medycznego, jak i poznawczego punktu widzenia. Skumulowana częstość wszystkich postaci tej heterogennej jednostki wynosi 0,9-1,4/1000 (2).

U znacznej większości pacjentów nie wykrywa się nieprawidłowości cytogenetycznych, które umożliwiłyby sklonowanie genu. W takich przypadkach analiza sprzężeń w rodzinach, w których możliwa jest obserwacja segregacji cechy genotypowej, jest najlepszą techniką mogącą prowadzić do lokalizacji i identyfikacji nowego genu. Analiza sprzężeń markerów umożliwia określenie interwału genomu o wielkości kilku centymorganów (tzn. kilku milionów par zasad), w którym z wysokim prawdopodobieństwem zlokalizowany jest gen odpowiedzialny za wystąpienie choroby. Analiza uzyskanych danych prowadzona jest z zastosowaniem metody lod score opracowanej w latach 50. (3), a następnie zmodyfikowanej (4). Podstawą metody lod score (ang. loga­rithm of the odds = logarytm szans) jest prawdopodobieństwo zaob­serwowania współwystąpienia „locus choroby” z badanym markerem przy założe­niu, że segregują one niezależnie. To prawdopodo­bieństwo jest następnie porówny­wane z prawdopodobieństwem wystąpienia tej samej kombinacji dwóch loci w badanej rodzi­nie, po przyjęciu różnych wartości częstości rekombinacji (ang. recombina­tion fraction, 0,0<θ<0,5). Wyliczany logarytm dziesiętny ze stosunku tych dwóch prawdopodobieństw określa lod score (Z(θ)), dla każdej z przyjętych wartości θ. Jest to tzw. analiza dwu­punktowa.

Dalsza analiza sprzężeń umożliwia określenie wszystkich markerów kosegregujących z chorobą w rodzinie i wytypowanie regionów kandydujących, w których następnie można poszukiwać nowych genów warunkujących chorobę. Strategia ta określana jest jako poszukiwanie genów kandydujących. Wiele genów MRX zostało zidentyfikowanych dzięki zastosowaniu opisanej metody. Są to np. geny PAK3, GDI1, ARX, DLG3, SLC6A8, PQBP1, FTSJ1 i JARID1C (5).

CEL PRACY

Celem pracy była próba wyjaśnienia przyczyny niepełnosprawności intelektualnej w 14 rodzinach poprzez lokalizację i identyfikację nowych genów, a także mutacji w znanych genach warunkujących izolowane postaci niespecyficznej niepełnosprawności intelektualnej sprzężonej z chromosomem X.

PACJENCI I METODY

Analizę sprzężeń wykonano w 14 rodzinach MRX. U wszystkich 132 osób przeprowadzono analizę 18 markerów mikrosatelitarnych, a w  rodzinach, w których wykazano istnienie sprzężenia w obrębie określonego regionu chromosomu X, przeanalizowano dodatkowe markery zlokalizowane w tym regionie.

Badania molekularne wykonywano techniką PCR z zastosowaniem znako­wa­nych fluore­scencyjnie starterów do znanych polimorficznych markerów mikrosatelitarnych. Stosowano dostępne zestawy (Applied Biosystems) do analizy 18 markerów zlokalizowanych na chromosomie X co około 10 cM, a także dodatkowe markery zlokalizowane co 5 cM. Reakcje PCR dla wszystkich markerów prowadzono w tych samych warunkach zgodnie z zaleceniami producenta. Markery zostały pogrupowane tak, aby można było w sekwenatorze rozdzielać je w jednej reakcji.

Analiza uzys­kanych danych została wykonana przy użyciu programów komputerowych do analiz z zakresu statystyki genetycznej pakiet LINKAGE m.in. MLINK, Genehunter Plus (Unix), dostępnych w internecie na serwerze FTP Rockefeller Univer­sity (ftp://linkage.rockefeller.edu/). Wyniki zostały policzone metodą lod score. Wykonywano analizę dwupunktową i wielopunktową.

W tym celu najpierw wprowadzano wyniki reakcji PCR wszystkich osób z rodziny do pliku w programie Cyrylic. Program umożliwia tworzenie rodowodów, wprowadzanie alleli markerów mikrosatelitarnych, a także eksportowanie danych w formacie akceptowanym przez programy z pakietu LINKAGE (tzw. pedigree file). Następnie tworzono tzw. parameter file. Zawiera on zakodowane w formie liczbowej informacje o badanej chorobie genetycznej i analizowanych markerach (m.in. sposób dziedziczenia, penetrację, częstość występowania), a pedigree file o badanej rodzinie i wynikach analizy markerów.

Po przeprowadzeniu opisanych powyżej badań analizowano wytypowany region poprzez wykorzystanie informacji z dostępnych baz danych (Ensembl – http://www.ensembl.org/, UCSC – http://www.genome.ucsc.edu/, NCBI – http://www.ncbi.nih.gov/). Umożliwia to odnalezienie zna­nych już genów MRX umiejscowio­nych w wytypowanym regionie chromosomu X, oraz wskazanie ewentual­nych genów kandy­dujących.

W ostatnim etapie badań u probanta prze­prowadzano sekwencjonowanie wybranych znanych genów MRX w celu ewentualnej identyfikacji pato­gennych mutacji, a także analizę rearanżacji (techniką MLPA, ang. multiplex ligation-dependent probe amplification) w obrębie wybranych genów. Przyjęty tryb postępowania wynika z tego, że analiza sprzężeń nie wskazuje genu, który jest zmutowany, a jedynie region, w którym gen jest umiejscowiony.

Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej.

WYNIKI

Podsumowanie wyników analizy sprzężeń przeprowadzonej we wszystkich 14 rodzinach przedstawiono schematycznie na rycinie 1. Szczegółowe wyniki analiz markerów mikrosatelitarnych zamieszczono na rodowodach poszczególnych rodzin, a wyniki analizy sprzężeń uzyskane przy zastosowaniu programu Genehunter Plus zostały przedstawione w postaci wykresów na rycinie 2.

Analiza sprzężeń jest procesem kilkuetapowym uwzględniającym zarówno określenie pozycji markerów ograniczających badany region (wyznaczają one obszar na chromosomie, w którym spodziewamy się obecności genu warunkującego chorobę w danej rodzinie), jak i podej­mowanie prób zmapowania genu.

W 14 rodzinach wyliczono lod score. Wynik informacyjny (dla chromosomu X lod score>2) uzyskano w dwóch rodzinach, w których na wykonanie badań zgodziło się przynajmniej osiem tzw. infor­ma­tyw­nych osób (FamG i FamD). W rodzinie FamD przyjęto, że penetracja mutacji wynosi 50%. W pozostałych, mniej liczebnych rodzinach, w których uzyskany wynik lod score jest <2, można prowadzić tzw. analizę wykluczeń. Wykazana kosegregacja określonych markerów z fenotypem, była podstawą do wykonania szczegółowej analizy genów, zlokalizowanych w wytypowanych regionach. Biorąc pod uwagę fakt, że wyniki analizy markerów mikrosatelitarnych były podstawą do wykluczenia z dalszych analiz określonych regionów chromosomu X, analiza taka nazywana jest „analizą wykluczeń”.

Przeprowadzona analiza sekwencji genów ARX, MECP2, PQBP1, IL1RAPL1, PAK3 (w przypadku gdy dany gen zlokalizowany był w niewykluczonym regionie) umożliwiła stwierdzenie patogennych mutacji w genie IL1RAPL1 w rodzinie FamG i FamKO, oraz w genie ARX w rodzinie FamC.

DYSKUSJA

W analizie sprzężeń nie zakłada się à priori, w którym locus poszukuje się mutacji. Jest to jedna z metod umożliwiająca identyfikację mutacji w tak heterogennych klinicznie i etiologicznie chorobach jak niepełnosprawność intelektualna. Postaci niepełnosprawności intelektualnej sprzężonej z chromosomem X współwystępujące z określonymi zespołami objawów klinicznych (MRXS), są najczęściej analizowane konwencjonalną metodą klonowania pozycyjnego, ponieważ podobny fenotyp umożliwia grupowanie rodzin do analizy sprzężeń. Dzięki temu uzyskiwane są wyższe wartości lod score, a interwały, w których lokalizowane są geny są stosunkowo niewielkie.

Sytuacja jest inna, gdy zamierza się identyfikować geny warunkujące izolowane postaci NI. Ze względu na ogromną heterogenność genetyczną i brak wyodrębnionego fenotypu, każda rodzina musi być analizowana indywidualnie. Z tego względu podstawowe znaczenie ma kolekcjonowanie odpowiednio liczebnych kohort dobrze scharakteryzowanych klinicznie pacjentów. W tym celu powstało europejskie konsorcjum EuroMRX założone w 1996 roku i grupujące pięć laboratoriów zajmujących się problemem NI sprzężonej z chromosomem X. W bazie konsorcjum znajduje się obecnie 400 rodzin z MRX i 200 rodzin z MRXS (6).

Niestety, jedynie w nielicznych rodzinach obciążonych NI sprzężoną z chromosomem X udaje się uzyskać informatywny lod score. Rodziny te określane są MRX i otrzymują indywidualny numer, dostępny w bazach danych, zgodny z nomenklaturą HUGO (7). Jednakże określenie regionu sprzężonego z chorobą nie zawsze prowadzi do sklonowania genu. Jeśli weźmiemy pod uwagę wielkość chromosomu X (163Mpz) i liczbę umiejscowionych na nim genów (1500), to możemy wyliczyć, że na 1Mpz wypada 7-10 genów (8, 9). Z powyższego szacunku wynika, że jeśli wytypowany przez analizę sprzężeń interwał nie jest wystarczająco mały, może zawierać nawet ponad 100 genów. Natomiast wyniki analizy sprzężeń mogą być bardzo użyteczne wtedy, gdy znany jest już gen zlokalizowany w danym regionie. Wówczas u probantów z wybranych rodzin możemy poszukiwać mutacji jedynie w genach umiejscowionych w sprzężonym regionie. Dotyczy to oczywiście również probantów z rodzin, dla których lod score w danym interwale był zbyt mały, aby zakwalifikować je jako MRX.

Większość z 14 objętych badaniami rodzin nie była wystarczająco liczebna do uzyskania wyniku lod score >2. Dla porównania wśród 600 rodzin z kolekcji European XLMR Consortium w 325 NI występuje u wielu mężczyzn w różnych pokoleniach, lecz tylko dla 61 rodzin uzyskano lod score>2 (2).

Uzyskane w niniejszej pracy wyniki wskazują, że podejmowanie analiz w małych rodzinach jest jednak uzasadnione. Powodów można wymienić kilka. Po pierwsze, umożliwia ona wykluczenie z analizy znaczących obszarów chromosomu X. Po drugie, prowadzone badania u kilku osób często są bodźcem dla innych członków rodziny do wyrażenia zgody na uczestnictwo w badaniach opartych o analizę sprzężeń. Po trzecie, w przypadku identyfikacji wariantu sekwencji o nieznanej funkcji, ułatwiona jest klasyfikacja wariantu na podstawie segregacji z fenotypem, lub lokalizacji zmutowanego genu na chromosomie X.

W dwóch rodzinach uzyskano lod score>2 (FamG i FamD). W rodzinie FamG w wytypowanym regionie zlokalizowane są dwa znane geny MRX. Analiza obu tych genów wykazała obecność delecji w IL1RAPL1. W tej rodzinie analiza segregacji umożliwiła potwierdzenie obecności mutacji u wszystkich chorych, a przede wszystkim jej wykluczenie u czterech potencjalnych nosicielek będących w wieku prokreacyjnym (10), co ma istotne znaczenia dla treści udzielanej im porady genetycznej w kontekście planów prokreacyjnych.

Patogenne mutacje stwierdzono też w 2 rodzinach z lod score<2. Uzyskane wyniki analizy genetycznej i klinicznej 4 chorych z rodziny FamC z mutacją c.428_451dup (24bp) w genie ARX łącznie z 15 innymi chorymi z 4 rodzin, były podstawą do zaproponowania badania tej mutacji w określonych przypadkach niepełnosprawności intelektualnej sprzężonej z chromosomem X (11, 12).

Do chwili obecnej wyjaśniono przyczynę NI w 3 spośród 14 rodzin, w których wykonywano analizę sprzężeń. W jednej z tych rodzin lod score był większy od 2, a w pozostałych, ze względu na niewystarczającą liczbę analizowanych osób, mniejszy od 2.

Badania w pozostałych rodzinach są kontynuowane. We wszystkich została znacząco zawężona liczba genów zakwalifikowanych do dalszej analizy. W pierwszej kolejności zdecydowano analizować geny o znaczącym udziale w etiologii MRX a mianowicie ARX, MECP2, PQBP1, IL1RAPL1, PAK3.W dalszej kolejności analizowane są geny JARID1C, SLC6A8, ACSL4, FTSJ1, a następnie geny o prawdopodobnie mniejszym udziale w etiologii XLMR (2). Oprócz analizy poszczególnych genów we wszystkich rodzinach wykonano również badania mające na celu identyfikację delecji i/lub duplikacji regionów chromosomu X techniką aCGH. Po przeanalizowaniu w wybranych rodzinach wszystkich znanych genów MRX, zlokalizowanych w wyznaczonych interwałach na chromosomie X, podjęte zostaną analizy genów kandydujących. Być może umożliwią one identyfikację nowych, nieznanych obecnie genów.

WNIOSKI

Uzyskane w niniejszej pracy wyniki wskazują, że podejmowanie analiz w małych rodzinach jest uzasadnione. Być może rozpoczęte analizy umożliwią w dalszych etapach pracy identyfikację nowych, nieznanych obecnie genów.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Leonard H., Wen X.: The epidemiology of mental retardation: challenges and opportunities in the new millennium. Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev., 2002, 8(3), 117-134.

2.    Kerr B., Turner G., Mulley J., Gedeon A., Partington M.: Non-specific X linked mental retardation. J. Med. Genet., 1991, 28(6), 378-382.

3.    Morton N.E.: Sequential tests for the detection of linkage. Am. J. Hum. Genet., 1955, 7(3), 277-318.

4.    Lathrop G.M., Lalouel J.M., Julier C., Ott J.: Strategies for multilocus linkage analysis in humans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81(11), 3443-3446.

5.    Chiurazzi P., Schwartz C.E., Gecz J., Neri G.: XLMR genes: update 2007. Eur. J. Hum. Genet., 2008, 16(4), 422-434.

6.    de Brouwer A.P., Yntema H.G., Kleefstra T., Lugtenberg D., Oudakker A.R., de Vries B.B., van Bokhoven H., Van Esch H., Frints S.G., Froyen G. i wsp.: Mutation frequencies of X-linked mental retardation genes in families from the EuroMRX consortium. Hum. Mutat., 2007, 28(2), 207-208.

7.    Mulley J.C., Kerr B., Stevenson R., Lubs H.: Nomenclature guidelines for X-linked mental retardation. Am. J. Med. Genet., 1992, 43(1-2), 383-391.

8.    Venter J.C., Adams M.D., Myers E.W., Li P.W., Mural R.J., Sutton G.G., Smith H.O., Yandell M., Evans C.A., Holt R.A. i wsp.: The sequence of the human genome. Science, 2001, 291(5507), 1304-1351.

9.    Lander E.S., Linton L.M., Birren B., Nusbaum C., Zody M.C., Baldwin J., Devon K., Dewar K., Doyle M., FitzHugh W. i wsp.: Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature, 2001, 409(6822), 860-921.

10.    Nawara M., Klapecki J., Borg K., Jurek M., Moreno S., Tryfon J., Bal J., Chelly J., Mazurczak T.: Novel Mutation of IL1RAPL1 Gene in a Nonspecific X-Linked Mental Retardation (MRX) Family. American Journal of Medical Genetics Part A 2008, 146A(24), 3167-3172.

11.    Nawara M., Szczaluba K., Poirier K., Chrzanowska K., Pilch J., Bal J., Chelly J., Mazurczak T.: The ARX mutations: a frequent cause of X-linked mental retardation. Am. J. Med. Genet., A 2006, 140(7), 727-732.

12. Szczaluba K., Nawara M., Poirier K., Pilch J., Gajdulewicz M., Spodar K., Chelly J., Bal J., Mazurczak T.: Genotype-phenotype associations for ARX gene duplication in X-linked mental retardation. Neurology, 2006, 67(11), 2073-2075.

..............................................................................................................................................................

Adres do korespondencji:

Magdalena Nawara
Zakład Genetyki Medycznej
Instytut Matki i Dziecka
ul. Kasprzaka 17a, 01-211 Warszawa
tel. (0-22) 32-77-313
fax (0-22) 32-77-200
magdalena.nawara@imid.med.pl