Medycyna Wieku Rozwojowego, 2009,XIII,3; 201-208

Zewnątrzkomórkowa domena receptora HER-2 jako czynnik prognostyczny w mięsaku kościopochodnym. Doniesienie wstępne

Iwona Ługowska1, Wojciech Woźniak1, Jadwiga Ambroszkiewicz2, Joanna Gajewska2, Katarzyna Szamotulska3


1Klinika Chirurgii Onkologicznej Dzieci i Młodzieży
Instytutu Matki i Dziecka
Kierownik: prof. dr hab. W. Woźniak


2Zakład Badań Przesiewowych Instytutu Matki i Dziecka
Kierownik: dr n. biol. M. Ołtarzewski


3Zakład Epidemiologii Instytutu Matki i Dziecka
Kierownik: dr n. med. K. Szamotulska

  • Tabela I. Charakterystyka kliniczno-patologiczna pacjentów
  • Tabela II. Wartość stężenia ECD/HER-2 w zależności od czynników kliniczno-patologicznych
  • Ryc. 1. Zależność między stężeniem ECD/HER-2 a wczesną progresją choroby z uwzględnieniem stadium zaawansowania klinicznego w chwili rozpoznania u chorych z mięsakiem kościopochodnym
  • Ryc. 2. Zależność między stężeniem ECD/HER-2 a śmiertelnością chorych z mięsakiem kościopochodnym
  • Ryc. 3. Całkowite przeżycie pacjentów z mięsakiem kościopochodnym w zależności od stężenia ECD/HER-2
  • Ryc. 4. Zależność między odpowiedzią histologiczną i stężeniem ECD/HER-2

Oznaczanie ekspresji receptora naskórkowego czynnika wzrostu HER-2 (ang. Human Epidermal Growth Factor Receptor-2) w tkance guza oraz ocena stężenia zewnątrzkomórkowej domeny receptora HER-2 (ang. Extracellular Domain of HER-2 receptor – ECD/HER-2) w surowicy krwi są pomocne w ustalaniu rokowania w wielu guzach litych.

Celem pracy była ocena przydatności oznaczania stężenia  ECD/HER-2 w ustaleniu rokowania u pacjentów z pierwotnym mięsakiem kościopochodnym.

Materiał i metoda: Do badania włączono 26 pacjentów (mediana wieku 15 lat; zakres 6-18 lat) z różnym stopniem zaawansowania klinicznego: stadium zlokalizowane choroby – 16 chorych, stadium IV – 10 pacjentów. Mediana czasu obserwacji 23 miesiące; zakres 13-44 miesięcy. Krew do badania pobierano w chwili przeprowadzania biopsji diagnostycznej. Stężenie ECD/HER-2 w surowi-
cy krwi oznaczono metodą  immunoenzymatyczną. 

Wyniki: Stężenie ECD/HER-2 mieściło się w zakresie 3,8-14,4 ng/ml (mediana 5 ng/ml). Progresja choroby wystąpiła znamiennie statystycznie częściej u pacjentów, u których stężenie ECD/HER-2 wynosiło >5 ng/ml (7/12 pacjentów), niż w przypadku gdy stężenie ECD/HER-2 było ≤5ng/ml (1/14 pacjentów); P=0,005. Wysokie stężenia ECD/HER-2 wiązało się także z obniżeniem odsetka przeżyć całkowitych: 50% dla ECD/HER-2 >5 ng/ml vs 93% dla ECD/HER-2 ≤5 ng/ml (P=0,057).

Wnioski: Wstępne wyniki wskazują, że oznaczanie stężenia ECD/HER-2 we krwi pacjentów z mięsakiem kościopochodnym może być przydatnym markerem w prognozowaniu efektu terapeutycznego, zwłaszcza w prognozowaniu wczesnej progresji choroby. Konieczne jest prowadzenie dalszych badań, które pozwolą jednoznacznie określić rokownicze znaczenie podwyższonego stężenia ECD/HER-2 w surowicy krwi u dzieci z mięsakiem kościopochodnym. Może to być także krokiem w stronę terapii prowadzonej z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych przeciwko receptorowi HER-2.

WSTĘP

Mięsak kościopochodny jest najczęściej występującym pierwotnym nowotworem złośliwym kości u dzieci i młodzieży (1). Najważniejszym elementem leczenia pacjenta z mięsakiem kościopochodnym jest operacyjne usunięcie możliwie wszystkich ognisk nowotworu, z równoczesnym stosowaniem chemioterapii wielolekowej. Po zastosowaniu kompleksowego leczenia onkologicznego, wyniki 5-letniego przeżycia całkowitego są na poziomie około 60% (2). Czynnikami negatywnie wpływającymi na rokowanie są przede wszystkim: obecność odległych przerzutów, lokalizacja ogniska pierwotnego w obrębie szkieletu osiowego, obecność żywych komórek nowotworowych powyżej 10% w mapie guza usuniętego operacyjnie, tzw. niekorzystna odpowiedź histologiczna na chemioterapię wstępną oraz podwyższona aktywność fosfatazy alkalicznej (zwłaszcza frakcji kostnej) (3, 4).

Wykazano, że potencjalnymi czynnikami rokowniczymi mogą być także: markery proliferacji komórkowej, do których należą białka z rodziny receptorów dla naskórkowego czynnika wzrostu, oraz antygeny proliferacyjne takie jak: jądrowe białko proliferacyjne PCNA (ang. Proliferating Cell Nuclear Antigen) and Ki-67. Istotną rolę w prognozowaniu przebiegu klinicznego odgrywają również białka odpowiedzialne za angiogenezę tj.: naczyniowo-śródbłonkowy czynnik wzrostu (ang. Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) i mechanizmy chemiooporności związane z ekspresją glikoproteiny P
(ang. Multidrug Resistance, MDR) (5, 6).

Jak wspomniano powyżej, w procesach proliferacji istotną rolę odgrywają receptorowe kinazy klasy I, zwane też: receptorami epidermalnych czynników wzrostowych, rodziną receptorów ErbB lub czasami rodziną receptorów RTK I (ang. Receptor Tyrosine Kinase Growth Factor Type I).

Jednym z receptorów należących do tej rodziny jest HER-2. Składa się on z trzech części: domeny zewnątrzkomórkowej – ECD/HER-2 (ang. Extracellular Domain of HER-2 Receptor, ECD/HER-2) odpowiadającej za specyficzne wiązanie receptora z ligandem,  helikalnej domeny przezbłonowej oraz z części cytoplazmatycznej o aktywności kinazy tyrozynowej. W wyniku aktywacji receptora dochodzi do fosforylacji reszty tyrozynowej w wewnątrzkomórkowej części receptora za pośrednictwem kinazy tyrozynowej, co inicjuje przekazanie sygnałów dla wzrostu i podziału komórek do jądra komórkowego. Stąd, efektem pobudzenia receptora jest aktywacja proliferacji komórkowej i zahamowanie procesu apoptozy, co sprzyja rozwojowi nowotworu oraz tworzeniu odległych przerzutów (7, 8). Prognostyczne i predykcyjne znaczenie ekspresji receptora HER-2 najlepiej poznane jest w raku piersi, a potwierdzenie jej obecności stanowi podstawę do rozpoczęcia leczenia trastuzumabem – przeciwciałem monoklonalnym skierowanym przeciwko białku HER-2 (9, 10). Badania prowadzone na liniach komórkowych mięsaka kościopochodnego nie wykazały jednoznacznie, w jaki sposób nadekspresja HER-2 wpływa na biologię mięsaka. Wiadomo jednak, że inne białka z rodziny ErbB, np. receptor dla naskórkowego czynnika wzrostu (ang. Endothelial Growth Factor Receptor, EGFR) odpowiadają za przekazanie sygnału o proliferacji mięsaka do jądra komórkowego (11, 12). Wyniki prac badawczych dotyczących prognostycznej roli nadekspresji HER-2 u pacjentów z mięsakiem kościopochodnym są niejednoznaczne i prowadzone były przede wszystkim z wykorzystaniem technik immunohistochemicznych (13, 14, 15, 16)

Oznaczanie ekspresji receptora HER-2 można również oceniać w pośredni sposób tzn. poprzez oznaczanie stężenia ECD/HER-2 w surowicy krwi. Ocena stężenia  ECD/HER-2 jest pomocna w określeniu rokowania u pacjentów z rakiem piersi, natomiast zmiany tego stężenia w trakcie chemioterapii mogą pomagać w monitorowaniu skuteczności leczenia (17, 18). W dostępnej literaturze napotkano tylko jedną, pilotażową pracę dotyczącą oznaczania ECD/HER-2 w złośliwych nowotworach kości (23).

Celem przedstawianej pracy była ocena przydatności oznaczania stężenia ECD/HER-2 w ustaleniu rokowania u pacjentów z pierwotnym mięsakiem kościopochodnym.

MATERIAŁ I METODA

Badaną grupę stanowiło 26 pacjentów (13 chłopców i 13 dziewcząt) z potwierdzonym histopatologicznie pierwotnym mięsakiem kościopochodnym. Pacjenci leczeni byli w latach 2005-2008 w Klinice Chirurgii Onkologicznej Dzieci i Młodzieży IMiD w Warszawie. Średnia wieku pacjentów wynosiła 14 lat, zakres od 6 do 18 lat. W chwili rozpoznania choroba w stadium zlokalizowanym była stwierdzana u 16 pacjentów, u pozostałych chorych obecne były odległe przerzuty. Postępowanie lecznicze rozpoczynano od chemioterapii przedoperacyjnej, po której operacyjnie usuwano ognisko pierwotne, a następnie kontynuowano chemioterapię. Usunięty operacyjnie materiał guza oceniano w badaniu histopatologicznym. Badanie to wykazało, że u 25 pacjentów usunięto ognisko pierwotne w granicach zdrowych tkanek (resekcja R0) natomiast u jednego pacjenta z guzem kości biodrowej – zabieg operacyjny był wykonany nieradykalnie (resekcja R1). Metastazektomię wykonywano w przypadku uzyskania stabilizacji choroby i możliwości operacyjnego radykalnego usunięcia zmian przerzutowych. Wszyscy pacjenci, którzy zakończyli leczenie obserwowani byli w Poradni Onkologicznej IMiD. Szczegółową charakterystykę kliniczno-patologiczną pacjentów przedstawiono w tabeli I.

Materiałem do oznaczeń stężenia ECD/HER-2 była krew żylna pobierana od pacjentów w chwili postawienia rozpoznania, tzn. przed rozpoczęciem chemioterapii wstępnej. Po odwirowaniu uzyskaną surowicę przechowywano w temperaturze -20°C do czasu wykonania badań biochemicznych. Oznaczenie stężeń ECD/HER-2 wykonano metodą immunoenzymatyczną z wykorzystaniem zestawów human sHER-2 ELISA (Bender MedSystems, USA). W celu wykluczenia błędów pomiarowych, oznaczenia wykonano dwukrotnie, a wyniki podano jako wartości średnie. Aby zapewnić kontrolę jakości wykonano oznaczenia prób kontrolnych dołączonych do każdego zestawu. Czułość stosowanego testu wynosiła 0,06 ng/ml. Powtarzalność metody wyrażona współczynnikiem wariancji CV zawierała się w akceptowalnym zakresie 1,9-5,8%.

Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej IMiD w Warszawie.

Uzyskane wyniki stężeń ECD/HER-2 analizowano pod względem ewentualnego związku z wiekiem i płcią pacjenta, a także z obrazem klinicznym, czyli: stadium zaawansowania klinicznego, wielkością guza, typem histologicznym mięsaka i stopniem agresywności histologicznej według WHO (19), odpowiedzią histologiczną guza na chemioterapię wstępną, przeżyciem całkowitym oraz przeżyciem wolnym od progresji choroby. W analizach statystycznych zastosowano współczynnik korelacji Spearmana, test Manna-Whitney’a, test chi2 i analizę przeżycia Kaplana-Meiera z testem log rank. Za poziom istotności testu przyjęto wartość P<0,05. Opracowanie statystyczne danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania SPSS 12.0.

WYNIKI

W analizowanej grupie chorych, przeżycie całkowite wynosiło 73%, a przeżycie wolne od progresji choroby 46%, przy medianie okresu obserwacji 23 miesiące: zakres od 14 do 44 miesięcy. Do progresji choroby i/lub nawrotu choroby doszło u 14 pacjentów (54%), przy czym u 8 chorych progresja choroby wystąpiła w ciągu pierwszych sześciu miesięcy leczenia onkologicznego. W badanej grupie 7 chorych zmarło.

Wartość stężenia ECD/HER-2 oceniana w surowicy krwi pobranej w chwili rozpoznania od 26 pacjentów wynosiła: średnia 5,94 ng/ml (SD±2,57); mediana 5 ng/ml (zakres 3,8-14,4 ng/ml). Rozkład wartości stężeń ECD/HER-2 odbiegał od rozkładu normalnego; z tego względu za punkt progowy przyjęto wartość mediany uznając stężenie ECD/HER-2 poniżej/lub równe 5 ng/ml za wartość niską, natomiast powyżej 5 ng/ml za wartość wysoką.

Mediana stężenia ECD/HER-2 w grupie pacjentów, u których doszło do wczesnej progresji choroby, wynosiła 6,2 ng/ml (zakres 4,8-14,4 ng/ml), natomiast u pacjentów bez progresji choroby była ona istotnie statystycznie niższa i wynosiła 4,8 ng/ml (zakres 3,8-13,2 ng/ml); P=0,014. Na rycinie 1 przedstawiono diagramy ilustrujące wartości stężeń ECD/HER-2 u pacjentów z wczesną progresją choroby, uwzględniając również stadium zaawansowania klinicznego w chwili rozpoznania.

Analizowano również związek między parametrami klinicznymi a wartością stężenia ECD/HER-2, przy uwzględnieniu zaproponowanego przez nas punktu progowego równego 5 ng/ml. W wyniku tej analizy wykazano przydatność oznaczania stężenia ECD/HER-2 do oceny ryzyka wczesnej progresji choroby. Progresja choroby wystąpiła znamiennie statystycznie częściej u pacjentów, u których ECD/HER-2 >5 ng/ml (7/12 pacjentów), niż w przypadku gdy ECD/HER-2 ≤5 ng/ml (1/14 pacjent); p=0,005.

Wysokie stężenie ECD/HER-2 przekładało się również na zwiększone ryzyko śmiertelności i niższy odsetek przeżyć całkowitych. ECD/HER-2 > 5 ng/ml stwierdzono u 6/7 pacjentów (86%), którzy zmarli oraz u 6/19 (32%) żyjących, p=0,014; (ryc. 2). Przeżycie całkowite w wymienionych grupach wynosiło odpowiednio: 50% vs 93%, p=0,057; (ryc. 3).

Ponadto, analiza zależności między odpowiedzią histologiczną guza na chemioterapię wstępną a stężeniem ECD/HER-2 w chwili postawienia rozpoznania wykazała, że przy wartości ECD/HER-2 >5 ng/ml mediana procentu żywego utkania wynosiła 30% i była wyższa niż w przypadku ECD/HER-2 ≤5 ng/ml – mediana 7,6%; p=0,081, (ryc. 4).

Nie stwierdzono związku pomiędzy stężeniem ECD/HER-2 (jako zmiennej ciągłej) a wiekiem, płcią, stadium zaawansowania, wielkością guza, typem histologicznym i stopniem agresywności histologicznej. Szczegółowe wyniki analizy zależności między parametrami klinicznymi a stężeniem ECD/HER-2 przy uwzględnieniu punktu progowego równego 5 ng/ml przedstawiono w tabeli II.

DYSKUSJA

U około połowy pacjentów ze zlokalizowanym mięsakiem kościopochodnym w chwili rozpoznania, dochodzi do ujawnienia się ognisk przerzutowych, pomimo stosowania skojarzonego leczenia przeciwnowotworowego (20). Identyfikacja czynników prognostycznych jest kluczowym elementem określenia rokowania, a następnie dostosowania intensywności leczenia onkologicznego do agresywności nowotworu.

W mięsaku kościopochodnym jednym z potencjalnych biologicznych czynników rokowniczych jest ekspresja HER-2.

Z danych literaturowych wynika, że ekspresję HER-2 najczęściej oceniano immunohistochemiczne, natomiast jej związek z rokowaniem jest niejednoznaczny.

Znaczenie rokownicze immunohistochemicznej nadekspresji HER-2 w mięsaku kościopochodnym po raz pierwszy wykazali Onda i wsp. (14). Autorzy zwrócili uwagę na fakt, że nadekspresja HER-2 wiąże się z wczesnym pojawieniem się przerzutów w płucach, a także z obniżeniem odsetka przeżyć całkowitych. Podobne wyniki przedstawili Gorlick i wsp. (15), którzy ponadto udowodnili, że nadekspresja HER-2 ma związek z niekorzystną odpowiedzią histologiczną na chemioterapię wstępną oraz ze skróconym okresem wolnym od choroby. Również w badaniach Scotlandi i wsp. (13) potwierdzono zależność pomiędzy krótszym okresem wolnym od choroby a nadekspresją HER-2.

We wcześniej prowadzonych badaniach własnych (21) również wykazano związek nadekspresji immunohistochemicznej HER-2 z gorszym rokowaniem i wystąpieniem progresji choroby w czasie leczenia onkologicznego. Progresja miejscowa wystąpiła u 16 spośród 22 pacjentów (73%) z ekspresją HER-2 powyżej 50%, a nie obserwowano jej u żadnego z 14 pacjentów z ekspresją tego białka poniżej 25%.

Jednakże w piśmiennictwie dostępne są też prace świadczące o przeciwnej zależności między nadekspresją HER-2 a rokowaniem w mięsaku kościopochodnym. Akatsuka i wsp. (16) oceniając immunohistochemicznie materiał biopsyjny pobrany od pacjentów ze zlokalizowaną postacią mięsaka kościopochodnego, wykazali związek nadekspresji HER-2 z wyższym odsetkiem przeżyć całkowitych.

Rozbieżność wyników prezentowanych badań może być spowodowana przede wszystkim niejednolitą metodologią prowadzonych oznaczeń, przygotowaniem tkanek do analiz, a także różną reaktywnością stosowanych przeciwciał monoklonalnych (9G6, 3B5, CB11, Tab250, GSF-HER2/) oraz poliklonalnych (A8010, A0485). Ponadto, w przedstawionych badaniach stosowano kilka sposobów oceny ekspresji HER-2 i przyjmowano różne punkty progowe.

W ocenie intensywności ekspresji białka HER-2 może pomóc oznaczanie stężenia zewnątrzkomórkowej domeny receptora HER-2 (ECD/HER-2) w surowicy krwi. U pacjentek z rakiem piersi wykazano, że intensywność ekspresji HER-2 w tkance guza koreluje ze stężeniem ECD/HER-2 w surowicy krwi i obniża się pod wpływem skutecznej chemioterapii (17, 18, 22). Jedyna publikacja dotycząca oznaczania stężenia ECD/HER-2 w mięsaku kościopochodnym została przedstawiona przez Holzera i wsp. (23). Autorzy analizowali stężenie ECD/HER-2 w grupie 35 pacjentów z guzami kości, w tym u 27 z mięsakiem kościopochodnym oraz u 8 z mięsakiem Ewinga. W wyniku tych badań wyciągnięto wniosek, że w grupie pacjentów z nowotworami złośliwymi kości oraz w grupie kontrolnej – stężenia ECD/HER-2 są porównywalne. Autorzy nie zaobserwowali też istotnych statystycznie różnic między średnimi wartościami ECD/HER-2 a śmiertelnością pacjentów. W naszych badaniach, podobnie jak we wspomnianym badaniu Holzera i wsp. (23), do oceny stężenia ECD/HER-2 użyto metody immunoenzymatycznej. Jednakże wyniki przeprowadzonej przez nas analizy wskazują, że w grupie pacjentów z mięsakiem kościopochodnym wysokie wartości stężenia ECD/HER-2 w chwili postawienia rozpoznania wiązały się z gorszą odpowiedzią na leczenie chemiczne, progresją choroby – zwłaszcza w pierwszych miesiącach leczenia oraz ze wzrostem śmiertelności. Ponadto, wykazano związek bliski istotności statystycznej między stężeniem ECD/HER-2 a odsetkiem żywego utkania nowotworowego. Do sformułowania ostatecznych wniosków konieczne są dalsze badania. Nie wykazaliśmy związku pomiędzy stężeniem ECD/HER-2 a stadium zaawansowania choroby, wielkością guza, typem i stopniem agresywności histologicznej mięsaka.

WNIOSKI

Wstępne wyniki wskazują,  że oznaczanie stężenia ECD/HER-2 we krwi pacjentów z mięsakiem kościopochodnym może być przydatnym markerem w prognozowaniu efektu terapeutycznego, zwłaszcza do przewidywania wczesnej progresji choroby. Konieczne jest prowadzenie dalszych badań, które pozwolą jednoznacznie określić rokownicze znaczenie podwyższonego stężenia ECD/HER-2 w surowicy w mięsaku kościopochodnym, co może być także krokiem w stronę terapii z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych przeciwko receptorowi HER-2.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Krzakowski M., Woźniak W.: Onkologia kliniczna, Borgis 2006, 1404-1408.

2.    Bielack S.S., Carrle D., Hardes J. i wsp.: Bone tumors in adolescents and young adults. Curr. Treat. Options Oncol., 2008, 9(1), 67-80.

3.    Bramer J.A., van Linge J.H., Grimer R.J., Scholten R.J.: Prognostic factors in localized extremity osteosarcoma: A systematic review. Eur. J. Surg. Oncol., 2009, Feb 19 [Epub ahead of print].

4.    Ambroszkiewicz J., Gajewska J., Klepacka T. i wsp.: Biochemical bone turnover markers in patients with conventional and nonconventional osteosarcoma. Pol. Merkur. Lekarski., 2006, 21(124), 330-334.

5.    Gorlick R., Anderson P., Andrulis I. i wsp.: Biology of childhood osteogenic sarcoma and potential targets for therapeutic development: meeting summary. Clin. Cancer Res., 2003, 15, 9(15), 5442-5453.

6.    Marina N., Gebhardt M., Teot L., Gorlick R.: Biology and therapeutic advances for pediatric osteosarcoma. Oncologist., 2004, 9(4), 422-441.

7.    Falkiewicz B., Bielawski K.P., Vogt U.: Budowa i funkcje receptorów ErbB (HER) Współcz. Onkol., 1999, 6, 241-243.

8.    Szacikowska E., Kozłowski W.: Rola receptorów HER i heregulin w powstawaniu przerzutów raka piersi. Współcz. Onkol., 2002, 6 (5),  312-321.

9.    Jassem J., Krasińska L.: Znaczenie rokownicze i predykcyjne HER2 w raku piersi. Współcz. Onkol., 2002, 6(5), 279-
-287.

10.    Sánchez-Muñoz A., García-Tapiador A.M., Martínez-Ortega E. i wsp.: Tumour molecular subtyping according to hormone receptors and HER2 status defines different pathological complete response to neoadjuvant chemotherapy in patients with locally advanced breast cancer. Clin. Transl. Oncol., 2008, 10(10), 646-653.

11.    Do S.I., Jung W.W., Kim H.S., Park Y.K.: The expression of epidermal growth factor receptor and its downstream signaling molecules in osteosarcoma. Int. J. Oncol., 2009, 34(3), 797-803.

12.    Clark J.C., Dass C.R., Choong P.F.: A review of clinical and molecular prognostic factors in osteosarcoma. J. Cancer Res. Clin. Oncol., 2008, 134(3), 281-297.

13.    Scotlandi K., Manara M.C., Hattinger C.M. i wsp.: Prognostic and therapeutic relevance of HER2 expression in osteosarcoma and Ewing’s sarcoma. Eur. J. Cancer., 2005, 41(9), 1349-1361.

14.    Onda M., Matsuda S., Higaki S. i wsp.: ErbB-2 expression is correlated with poor prognosis for patients with osteosarcoma. Cancer, 1996, 77(1), 71-78.

15.    Gorlick R., Huvos A.G., Heller G. i wsp.: Expression of HER2/erbB-2 correlates with survival in osteosarcoma. J. Clin. Oncol., 1999 Sep. 17(9), 2781-2788.

16.    Akatsuka T., Wada T., Kokai Y. i wsp.: ErbB2 expression is correlated with increased survival of patients with osteosarcoma. Cancer,  2002, 94(5), 1397-1404.

17.    Leary A.F., Hanna W.M., van de Vijver M.J. i wsp.: Value and limitations of measuring HER-2 extracellular domain in the serum of breast cancer patients. J. Clin. Oncol., 2009 Mar 2. [Epub ahead of print].

18.    Carney W.P., Neumann R., Lipton A. i wsp.: Potential clinical utility of serum HER-2/neu oncoprotein concentrations in patients with breast cancer. Clin. Chem., 2003, 49(10), 1579-1598.

19.    Dorfman H.D., Czernik B., Kotz R. i wsp.: WHO Classification of Bone Tumours. http://www.iarc.fr/IARCPress/pdfs/bb5/bb5-classifbone.pdf.

20.    Picci P.: Osteosarcoma (osteogenic sarcoma). Orphanet J. Rare Dis., 2007, 23(2), 6.

21.    Ługowska I.: Ocena przydatności badań immuno-
-histochemicznych w mięsaku kościopochodnym u dzieci w korelacji z przebiegiem klinicznym i rokowaniem. I.M.Dz. 2008 - praca doktorska – publikacja w przygotowaniu.

22.    Lebeau A., Deimling D., Kaltz C. i wsp.: Her-2/neu analysis in archival tissue samples of human breast cancer: comparison of immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization. J. Clin. Oncol., 2001, 19(2), 354-363.

23.    Holzer G., Pfandlsteiner T., Koschat M. i wsp.: Soluble p185(HER-2) in patients with malignant bone tumours. Pediatr. Blood Cancer, 2005, 44(2), 163-166.

..............................................................................................................................................................

Adres do korespondencji:

Iwona Ługowska

Klinika Chirurgii Onkologicznej
Dzieci i Młodzieży IMiD
ul. Kasprzaka 17a, 01-211 Warszawa,
tel. (0-22) 32-77-205
kiwonka@wp.pl