Medycyna Wieku Rozwojowego, 2009,XIII,3; 180-186

Warianty alleliczne TPMT a ryzyko leukopenii i neutropenii u pacjentów leczonych z powodu ostrej białaczki

Ewa Niedzielska, Małgorzata Niedzielska, Alicja Chybicka


Klinika Transplantacji Szpiku, Onkologii i Hematologii Dziecięcej
Akademii Medycznej we Wrocławiu
Kierownik: prof. dr hab. A. Chybicka

  • Tabela I. Sekwencje starterów dla TPMT
  • Tabela II. Analiza wybranych parametrów morfologii u pacjentów z rozpoznaniem ostrej białaczki w trakcie całego okresu leczenia dla heterozygot TPMT (*2, *3A lub *3C) vs homozygoty TPMT*1/*1
  • Tabela III. Analiza wybranych parametrów morfologii u pacjentów z rozpoznaniem ostrej białaczki na poszczególnych etapach leczenia (okresy I-VI) dla heterozygot TPMT (*2, *3A lub *3C) vs homozygoty TPMT*1/*1
  • Tabela IV. Analiza wybranych parametrów morfologii u pacjentów z rozpoznaniem ostrej białaczki na poszczególnych etapach leczenia (okresy I-VI) dla heterozygot TPMT (*2, *3A lub *3C) vs homozygoty TPMT*1/*1
  • Tabela V. Analiza wybranych parametrów morfologii u pacjentów z rozpoznaniem ostrej białaczki na poszczególnych etapach leczenia (okresy I-VI) dla heterozygot TPMT (*2, *3A lub *3C) vs homozygoty TPMT*1/*1
  • Tabela VI. Analiza wybranych parametrów morfologii u pacjentów z rozpoznaniem ostrej białaczki na poszczególnych etapach leczenia (okresy I-VI) dla heterozygot TPMT (*2, *3A lub *3C) vs homozygoty TPMT*1/*1
  • Tabela VII. Analiza wybranych parametrów morfologii u pacjentów z rozpoznaniem ostrej białaczki na poszczególnych etapach leczenia (okresy I-VI) dla heterozygot TPMT (*2, *3A lub *3C) vs homozygoty TPMT*1/*1
  • Tabela VIII. Analiza wybranych parametrów morfologii u pacjentów z rozpoznaniem ostrej białaczki na poszczególnych etapach leczenia (okresy I-VI) dla heterozygot TPMT (*2, *3A lub *3C) vs homozygoty TPMT*1/*1
  • Tabela IX. Analiza wybranych parametrów morfologii u pacjentów z rozpoznaniem ALL i w trakcie całego okresu leczenia dla heterozygot TPMT (*2, *3A lub *3C) vs homozygoty TPMT*1/*1
  • Tabela X. Analiza wybranych parametrów morfologii u pacjentów z rozpoznaniem AML i w trakcie całego okresu leczenia dla heterozygot TPMT (*2, *3A lub *3C) vs homozygoty TPMT*1/*1

Cel: Celem pracy było zbadanie wpływu polimorfizmu genetycznego TPMT (S-metylotransferaza tio-purynowa) na wystąpienie działań niepożądanych terapii, w postaci zaburzeń hematologicznych  pod postacią leukopenii i neutropenii, po zastosowaniu preparatów tiopurynowych.

Materiał i metody: Grupę badaną stanowiło 210 pacjentów (121 chłopców, 89 dziewczynek) w wieku od 1 do 18 lat  (mediana 7 lat, średnia 8 lat, SD±5,32) leczonych z powodu białaczki (ostrej białaczki limfoblastycznej ALL: n=167; ostrej białaczki szpikowej AML: n=43). U każdego dziecka analiza działań niepożądanych leczenia odbyła się zgodnie ze skalą toksyczności wg WHO, w trakcie całego okresu obserwacji oraz na poszczególnych etapach (6 okresów).

Wyniki:
Analiza zmian wybranych parametrów morfologii, z całego okresu leczenia, w grupie pacjentów z ostrymi białaczkami pokazała, że w przypadku gdy jednym z alleli jest wariant TPMT *2, *3A lub *3C istotnie statystycznie częściej dochodzi do spadku wartości WBC (p=0,0025) oraz neutrofili (p=0,019). Szczegółowa ocena w poszczególnych okresach leczenia wykazała, że u heterozygot dla TPMT nasilona leukopenia występowała znamiennie częściej tylko we wczesnej reindukcji (p=0,012).

Wnioski: Podanie preparatów tiopurynowych wiąże się z nasileniem toksyczności leczenia cytostatycznego u heterozygot dla TPMT.

WSTĘP

S-metylotransferaza tiopurynowa (TPMT) bierze udział w metabolizmie, m.in. 6-MP (6-merkaptopuryny), 6-TG (6-tioguaniny) – leków przeciwbiałaczkowych stosowanych w leczeniu indukcyjnym oraz podtrzymującym remisję w ALL oraz AML u dzieci. Wiele danych literaturowych wskazuje na zróżnicowany metabolizm preparatów tiopurynowych u pacjentów z wadliwą aktywnością enzymu TPMT (1). Nagromadzenie aktywnych metabolitów merkaptopuryny i tioguaniny, z powodu braku możliwości ich przetwarzania przez S-metylotransferazę tiopurynową, grozi większą supresją szpiku odnoszącą się przede wszystkim do obniżenia układu białokrwinkowego, co związane jest każdorazowo z bezpośrednim zagrożeniem życia dziecka (2, 3). Wyniki dostępnych badań wskazują, że postulowana redukcja dawki preparatów tiopurynowych, ustalona na podstawie genotypu jeszcze przed rozpoczęciem terapii, mogłaby a priori w grupie pacjentów z upośledzoną pracą enzymu zmniejszyć nasilenie działań niepożądanych w postaci leukopenii z agranulocytozą (lub pancytopenii) (4).

W przypadku oceny aktywności enzymów biorących udział w biotransformacji leków wyróżnia się fenotypowo odmienne grupy: PM (poor metabolizer – „wolny metabolizer”), IM (intermediate metabolizer – „pośredni metabolizer”), UM (ultrarapid metabolizer – „szybki metabolizer”), EM (efficient metabolizer – „przeciętny metabolizer”). U osób słabo lub w ogóle niemetabolizujących leku (PM) do postaci nieaktywnej, która może być wydalona z ustroju, często dochodzi do jego nasilonego działania. Z tym faktem wiąże się zwiększone ryzyko działań niepożądanych na skutek kumulacji leku. U osób z fenotypem PM należy podawać dawki leku dużo mniejsze od standardowych, aby uniknąć toksyczności preparatów, szczególnie o małym współczynniku terapeutycznym jak cytostatyki. Z drugiej strony u osób z fenotypem wolnego metabolizera w przypadku, gdy enzym odpowiada za przemianę z proleku do formy aktywnej, należy spodziewać się zmniejszonego lub wręcz braku efektu terapeutycznego danego preparatu. Również wzmożona biotransformacja leku (fenotyp UM), prowadzi do jego szybkiej eliminacji, a zatem krótszego czasu działania, czyli potencjalnie mniejszej skuteczności i potrzeby zwiększenia dawek. Z kolei u osób z najczęstszym fenotypem EM standardowe dawki leków będą prawidłowo tolerowane.

MATERIAŁ I METODY


Grupę badaną stanowiło 210 pacjentów (121 chłopców, 89 dziewczynek) w wieku od 1do 18 (mediana 7 lat, średnia 8 lat, SD±5,32) leczonych z powodu ostrej białaczki (ALL: n=167; AML: n=43).

Materiał badawczy stanowił bioptat szpiku kostnego lub krew obwodowa uzyskane w trakcie rutynowych badań. Procedura izolacji DNA prowadzona była przy użyciu standardowych zestawów. Genotypowanie dla TPMT w zakresie wybranych polimorfizmów: TPMT*2,*3A,*3C przeprowadzono metodą RFLP (polimorfizmy długości fragmentów restrykcyjnych). Po zamplifikowaniu fragmentów DNA przy użyciu odpowiednich starterów (tab. I) trawienie enzymatyczne wykonywano przy pomocy enzymów restrykcyjnych HpyF10VI (MwoI) i XmiI (AccI). Produkty cięcia rozdzielano w procesie elektroforezy na 4% żelu agarozowym.

U każdego dziecka analiza działań niepożądanych leczenia odbyła się zgodnie ze skalą toksyczności wg WHO, w trakcie całego okresu obserwacji oraz na poszczególnych etapach (6 okresów).

Do wykonania obliczeń wykorzystano program Statistica 7.0. Weryfikacja hipotezy o równości średnich poszczególnych prób przeprowadzono metodą analizy wariancji ANOVA lub dla grup o niejednorodnej wariancji testem nieparametrycznym sumy rang Wilcoxona (jednorodność wariancji sprawdzona testem Levene’a). Weryfikacja hipotezy o równości średnich dla parametrów powiązanych (zmiany w czasie) przeprowadzono testem t-Studenta dla par lub dla grup o niejednorodnej wariancji testem nieparametrycznym kolejności par Wilcoxona (jednorodność wariancji sprawdzono testem Levene’a).

Projekt został pozytywnie zaopiniowany przez komisję bioetyki. Każdorazowo przed rozpoczęciem rekrutacji uzyskano zgodę rodziców i pacjentów (>16 lat) na badanie.

WYNIKI

Analiza zmian wybranych parametrów morfologii, z całego okresu leczenia, w grupie dzieci z ostrymi białaczkami pokazała, że u pacjentów posiadających jeden z wariantów: TPMT *2, *3A lub *3C istotnie statystycznie częściej dochodzi do spadku wartości WBC (p=0,0025) oraz neutrofili (p=0,019) w porównaniu do osób tylko z wariantem dzikim (TPMT*1/*1) (tab. II).

Szczegółowa ocena w poszczególnych okresach leczenia wykazała, że u heterozygot względem TPMT nasilona leukopenia występowała znamiennie częściej tylko we wczesnej reindukcji (p=0,012) (tab. III-VIII).

Po rozdzieleniu grupy badanej ze względu na rozpoznanie choroby podstawowej, u pacjentów z ostrą białaczką limfoblastyczną i fenotypem IM również potwierdzono istotnie statystycznie częstsze ryzyko leukopenii (p=0,006) oraz neutropenii (p=0,015), nie wykazano jednak podobnych korelacji u dzieci z ostrą białaczką szpikową (tab. IX i X).

Stwierdzane w całym okresie leczenia ostrej białaczki wyższe toksyczności wg WHO dotyczące agranulocytozy, u pacjentów z wariantami TPMT*2, *3A lub*3C, nie znalazły swojego odzwierciedlenia na żadnym z etapów leczenia w trakcie szczegółowej analizy. Należy jednak zauważyć, że ogólny trend poziomu WBC i neutrofilii był identyczny w trakcie dwuletniej obserwacji dla grupy z wadliwą pracą enzymu TPMT. Znamiennie w końcowym etapie leczenia u heterozygot poziom WBC i neutrofili kształtował się między pierwszym a drugim stopniem toksyczności wg WHO, podczas gdy u pacjentów bez mutacji był najczęściej już w stopniu zerowym.

DYSKUSJA

Uzyskane wyniki u pacjentów leczonych z powodu ostrych białaczek pokazują, że upośledzona praca TPMT i gromadzenie aktywnych postaci merkaptopuryny oraz tioguaniny najsilniej wpływa na mielosupresję szpiku. Istotnie statystycznie niższe wartości leukocytów u pacjentów heterozygotycznych względem TPMT uwidoczniły się jednak tylko dla okresu wczesnej reindukcji (okres IV), co może oznaczać, że pacjenci z wadliwą pracą enzymu TPMT szczególnie źle tolerowali wyższe dawki merkaptopuryny lub tioguaniny dopiero po okresie około czterech miesięcy od rozpoczęcia leczenia. Tym samym nasilenie leukopenii u heterozygot najprawdopodobniej wiąże się z otrzymaniem pewnej kumulacyjnej dawki merkaptopuryny lub tioguaniny, po przekroczeniu której kolejne podania leków nie wpływają już tak znamiennie na supresję szpiku. Analiza poziomu wartości WBC na kolejnych etapach leczenia również wskazała na odmienny trend u pacjentów z wykrywanymi mutacjami względem osób z wariantem dzikim. W obu grupach podczas leczenia podtrzymującego remisję obserwowano wzrost poziomu leukocytów, ale znacznie słabiej był on wyrażony u heterozygot. Ponadto nie wykazano, żeby w grupie pacjentów z polimorfizmem TPMT istotnie statystycznie częściej redukowano dawki merkaptoputyny, tioguaniny czy metotreksatu w zależności od poziomu aktualnej liczby leukocytów (zgodnie z protokołem leczniczym).

Rola wpływu polimorfizmu genetycznego na przemianę leków tiopurynowych była przedmiotem wielu badań, również u pacjentów z białaczkami. Między innymi w pracy Dervieux T. i wsp. znaczenie polimorfizmu TPMT dla przemiany 6-MP oraz 6-TG oceniano poprzez określenie odstępstw od planowej realizacji protokołu z powodu toksyczności, a także ryzyka wznów i zgonów (6). Badania dotyczyły grupy 78 pacjentów z rozpoznaniem ALL. Analizowano czy profil farmakogenetyczny dla TPMT koreluje z odpowiedzią na chemioterapię z użyciem merkaptorpuryny. U 8 osób (10%) wykazano polimorfizm genetyczny w zakresie TPMT (1 homozygota i 7 heterozygot), pozostali pacjenci posiadali allel dziki. Przez 8 tygodni u każdego z badanych monitorowano liczbę leukocytów oraz nasilenie powikłań infekcyjnych. Wyniki wskazały, że większa aktywność TPMT była dodatnio skorelowana z wyższym poziomem WBC (p<0,01) i wyższą dawką sumaryczną G-MP, którą pacjenci otrzymali w trakcie terapii (p=0,03). Z kolei u osób z mniejszą aktywnością metaboliczną TPMT częściej obserwowano niższy poziom leukocytów w stosunku do grupy homozygot dla allelu dzikiego (2,83 vs 3,39 tys./mm3; p<0,003), co powodowało, że u pacjentów tych zgodnie z protokołem częściej obniżano dawkę 6-MP ze względu na spadek liczby WBC <1500 tys./m3 (48 vs 65 mg/m2/dzień; p<0,02).

Również badania Oliveira E. i wsp. objęły 110 pacjentów z rozpoznaniem ALL, u których oceniono profil farmakogenetyczny dla metabolizmu merkaptopuryny (7). Obecność mutacji TPMT*3A, *3C, *2 lub *8 wykazano w 11,8% przypadków, pozostali pacjenci byli homozygotami dla allelu dzikiego. Analiza nasilenia działań niepożądanych w obu tych grupach wskazała na większe ryzyko toksyczności terapii u heterozygot, jednak nie było ono istotne statystycznie. Badacze zakładają zwiększenie grupy dla pełniejszej oceny parametrów hematologicznych.

Również w badaniach Lewing K. i wsp. dotyczących pacjentów z ALL-SR pokazano, że dzieci posiadające allel prawidłowy dla genu TPMT znacznie lepiej tolerowały wyższe dawki 6-MP i 6-TG w porównaniu do pozostałej grupy (8). U heterozygot (11%) i homozygot dla allelu zmutowanego (*2-*6) częściej obserwowano nasilone objawy mielosupresji w trakcie leczenia (PLT <50 tys./ul; neutrofile <500 tys./ul). Działania niepożądane wymagały zastosowania przerw w leczeniu w tej grupie pacjentów. U dzieci z fenotypem IM i PM częściej redukowano dawki preparatów tiopurynowych (25 do 50% dawki standardowej), ze względu na większe spadki parametrów morfologii.

Wykazana w badaniach własnych nasilona leukopenia z agranulocytozą u heterozygot względem TPMT, w porównaniu do grupy z allelem dzikim, mogła powodować dłuższe okresy immunosupresji, co za tym idzie większe ryzyko infekcji, wiązać się z częstszym stosowaniem antybiotykoterapii i leków przeciwgrzybicznych, i w rezultacie wydłużać pobyt dziecka w szpitalu (9). Jednocześnie codzienna praktyka kliniczna w oddziałach hematoonkologicznych pokazuje, że towarzysząca aplazji szpiku gorączka, bez uchwytnych przyczyn zakażenia (FUO – Fever of Unknown Origin) pozostaje jednym z najczęstszych powodów powikłań i zagrożeń terapii podczas całego okresu leczenia ostrej białaczki.

Dla przeprowadzenia pełnej analizy ryzyka wystąpienia działań niepożądanych, w zależności od oznaczonego genotypu dla TPMT, wykonano identyczne w założeniach obliczenia po rozdzieleniu grupy badanej ze względu na rozpoznanie ostrej białaczki. Jedynie w przypadku chorych z ALL uzyskane wyniki potwierdziły większość wcześniej opisanych istotności statystycznych. Należy jednak zauważyć, że u dzieci z AML obserwowany był identyczny jak w pozostałej populacji badanej trend, wskazujący na silniej wyrażoną mielosupresję szpiku u pacjentów z upośledzoną pracą enzymu TPMT. Na uzyskaną dysproporcję wyników u pacjentów z ALL i AML, mogło mieć wpływ rozbicie grupy o fenotypie IM (heterozygot) w zależności od typu białaczki. Dla pełniejszej analizy należałoby zwiększyć badane podgrupy.

U heterozygot dla TPMT odnotowano nagłe załamanie wzrostu leukocytów we wczesnej reindukcji i znaczne obniżenie poziomu WBC na zakończenie leczenia w stosunku do posiadaczy wariantu dzikiego. Pacjenci o fenotypie IM w populacji dzieci z ALL uzyskiwali w końcowej fazie terapii WBC w 2 st. wg WHO, natomiast z fenotypem EM w stopniu od 0-1 wg WHO. Nie obserwowano również, żeby istotnie statystycznie częściej w grupie heterozygot redukowano dawkę 6-MP w zależności od kontrolnych poziomów WBC w trakcie leczenia podtrzymującego remisję.

Praca Relling M. i wsp. pokazała, że szczególnie okres lpr może być ważny dla wykazania różnic w nasileniu działań niepożądanych po zastosowaniu preparatów tiopurynowych (10). Badania dotyczyły oceny powikłań terapii u dzieci z ALL w trakcie leczenia podtrzymującego z uwzględnieniem polimorfizmu genetycznego TPMT. Na podstawie przeprowadzonej analizy okazało się, że osoby określane mianem EM przyjmowały pełne dawki 6-MP przez ponad 80% okresu leczenia podtrzymującego, z kolei redukcja dawki tiopuryn z uwagi na obecne toksyczności wymagana była przez ponad 65% okresu leczenia u IM i aż w 76% tego okresu u osób z fenotypem PM. U heterozygot i homozygot dla zmutowanych alleli w okresie leczenia podtrzymującego remisję najdłużej utrzymywały się: neutropenia, małopłytkowość oraz gorączka, a tolerancja dla pełnych dawek leczenia 6-MP była znacznie obniżona.

Przedstawionym w pracy własnej wahaniom leukopenii, u pacjentów z ALL i wariantem polimorficznym dla S-metylotrasferazy tiopurynowej, nie towarzyszyły podobne zmiany w zakresie wartości granulocytów obojętnochłonnych. Poziom neutrofilii wzrastał w trakcie półtorarocznej obserwacji równomiernie w całej grupie z rozpoznaniem ALL, niezależnie od posiadanego geno-typu dla TPMT. Ponadto należy zauważyć, że chociaż grupa pacjentów o fenotypie IM leczonych z powodu ostrej białaczki szpikowej nie była duża i badanie ma charakter pilotażowy, to jednak otrzymane wyniki w obliczu niewielkiej ilości przeprowadzonych do tej pory obserwacji dla dzieci z AML, wydają się być szczególnie wartościowe. Pokazano, że zmniejszona praca S-metylotransferazy tiopurynowej, może nasilać również działania niepożądane terapii pozostałymi preparatami tiopurynowymi, poprzez wpływ na kumulację aktywnych metabolitów 6-TG w organizmie. Jest to szczególnie ważne, biorąc pod uwagę, że leki te są stosowane przewlekle również z powodu innych schorzeń niż ostre białaczki, m.in. w reumatologii, gastrologii i nefrologii (11,12). U osób o fenotypie IM lub PM leczenie tioguaniną lub azatiopryną może również potencjalnie wzmagać ryzyko supresji szpiku podobnie jak u pacjentów z ALL, powodować powikłania infekcyjne i stwarzać zagrożenie dla powodzenia terapii (13).

WNIOSKI

Wyższe stopnie toksyczności dla parametrów morfologii, obserwowane w trakcie całego okresu leczenia u pacjentów o fenotypie IM, wskazują na gorsze możliwości odnowy hematologicznej. Ponadto zwraca uwagę fakt, że upośledzona przemiana leków tiopurynowych nasila się szczególnie na etapie wczesnej reindukcji (dla WBC, PLT) i nie jest już tak silnie wyrażona w trakcie dalszego leczenia podtrzymującego remisję.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Dokmanovic L.¸ Urosevic J., Janic D., Jovanovic N., Petrucev B. i wsp.: Analysis of thiopurine S-methyltransferase polymorphism in the population of Serbia and Montenegro and mercaptopurine therapy tolerance in childhood acute lymphoblastic leukemia. Therapeutic drug monitoring, 2006, 28, 800-806.

2.    Relling M.V., Hancock M.L., Boyett J.M. i wsp.: Prognostic importance of 6-mercaptopurine dose intensity in acute lymphoblastic leukemia. Blood, 1999, 93, 2817-2823.

3.    Lennard L., Rees C.A., Lilleyman J.S., Maddocks J.L.: Childhood leukaemia: a relationship between intracellular 6-mercaptopurine metabolism and neutropenia. Br. J. Clin. Pharmacol., 1983, 16, 359-363.

4.    Toward M.: Individualized dosing in pediatric ALL. Blood, 2005, 105, 4544-4545.

5.    Yates C.R., Krynetski E.Y., Loennechen T., Fessing M.Y., Tai H.L. i wsp.: Molecular diagnosis of Thiopurine S-methyltransferase deficiency: genetic basis for Azathioprine and Mercaptopurine intolerance. Annals of Internal Medicine, 1997, 126, 608-
-614.

6.    Dervieux T., Me´dard Y., Verpillat P., Guigonis V., Duval M. i wsp.: Possible implication of thiopurine S-methyltransferase in occurrence of infectious episodes during maintenance therapy for childhood lymphoblastic leukemia with mercaptopurine. Leukemia, 2001, 15, 1706-1712.

7.    Oliveira E., Alves S., Quental S., Ferreira F., Norton L. i wsp.: Outcome in acute lymphoblastic leukemia: Influence of thiopurine methyltransferase genetic polymorphisms. International Congress Series, 2006, 1288, 789-791.

8.    Lewing K., Leeder J.S., Bostrom B., Gaedigk A., Erdmann G. i wsp.: Thiopurine Methyltransferase (TPMT) Deficiency and Excessive Myelosuppression Among Children on Treatment for Standard Risk Acute Lymphoblastic Leukemia (SR-ALL). 2001, ASCO Annual Meeting.

9.    Lazarou J., Pomeranz B.H., Corey P.N.: Incidence of adverse drug reactions in hospitalized patients: a meta-analysis of prospective studies. JAMA, 1998, 279, 1200-1205.

10.    Relling M.V., Hancock M.L., Rivera G.K., Sandlund J.T., Ribeiro R.C. i wsp.: Mercaptopurine therapy intolerance and heterozygosity at the thiopurine S-methyltransferase gene locus. J. Natl. Cancer Inst., 1999, 91, 2001-2008.

11.    Stolk J.N., Boerbooms A.M., De Abreu R.A. i wsp.: Reduced thiopurine methyltransferase activity and development of side effects of azathioprine treatment in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum., 1998, 41, 1858-1866.

12.    Schwab M., Schaeffeler E., Marx C., Zanger U., Aulitzky W. i wsp.: Shortcoming in the diagnosis of TPMT deficiency in a patient with Crohn’s disease using phenotyping only. Gastroenterology, 2001, 121, 498-499.

13.    Colombel J.F., Ferrari N., Debuysere H., Marteau P., Gendre J.P. i wsp.: Genotypic analysis of thiopurine S-methyltransferase in patients with Crohn’s disease and severe myelosuppression during azathioprine therapy. Gastroenterology, 2000, 118, 1025-1030.

..............................................................................................................................................................

Adres do korespondencji:

Ewa Niedzielska

ul. Opolska 127B/18,
52-011 Wrocław
tel. 604-194-749
eniedzielska@poczta.onet.pl