*Praca finansowana w ramach projektu badawczego MNiSW Nr 2PO5E 125 27

WSTĘP

Wśród czynników zaangażowanych w utrzymanie homeostazy immunologicznej w organizmie istotną rolę przypisuje się transformującemu czynnikowi wzrostu – beta (TGF-β − transforming growth factor) (1). Poznano pięć izoform TGF-β, trzy z nich (TGF-β1, -β2, -β3) występują u ssaków, w tym u ludzi (2). U ludzi gen kodujący TGF-β1 jest zlokalizowany na krótkim ramieniu chromosomu 19 (3).

Wśród złożonych właściwości TGF-β1 można wyodrębnić dwie główne sfery jego aktywności biologicznej. Pierwsza z nich, to wpływ na procesy proliferacji i różnicowania komórek. W obrębie poszczególnych tkanek i narządów działanie TGF-β1 polega na wspomaganiu procesów mających na celu regenerację uszkodzeń pourazowych bądź chorobowych. Stymuluje on produkcję składników macierzy zewnątrzkomórkowej, zwłaszcza fibronektyny, kolagenu i proteoglikanów. W warunkach chorobowych może to prowadzić do wystąpienia patologicznego włóknienia. W wątrobie wywołuje także transformację komórek gwiaździstych (lipocyty, komórki Ito) do miofibroblastów, a w obrębie przewodu pokarmowego stymuluje znajdujące się tam komórki mięśni gładkich do produkcji kolagenu (2, 4).

Druga podstawowa aktywność biologiczna TGF-β1 to działanie immunomodulacyjne. Szereg chorób może wynikać z niedostatecznej lub z nadmiernej aktywności biologicznej TGF-β1. Wykazano, że nagromadzenie TGF-β1 w wątrobie jest głównym czynnikiem odpowiedzialnym za jej włóknienie u chorych z przewlekłymi zapaleniami wątroby (PZW), przede wszystkim o etiologii wirusowej (HBV, HCV) (5, 6, 7).

W związku z tym, iż coraz więcej danych wskazuje na to, że istotą etiopatogenezy przewlekłych procesów zapalnych jest zmieniona aktywność biologiczna cytokin, w tym także transformującego czynnika wzrostu beta1 (TGF-β1), celowe wydaje się szczegółowe poznanie jego roli w przewlekłych zapaleniach wątroby u dzieci, zwłaszcza, że doniesienia dotyczące tej grupy wiekowej są nieliczne.

CEL PRACY

Celem pracy była próba oceny, w jakim stopniu w patogenezie przewlekłych zapaleń wątroby (PZW) u dzieci, uczestniczy transformujący czynnik wzrostu beta-1 (TGF-β1), a także próba ustalenia, czy oznaczanie zawartości tej cytokiny we krwi lub w tkance może być pomocne w rozpoznawaniu i ocenie stopnia zaawansowania tych schorzeń.

PACJENCI I METODY

Badaniami objęto 63 dzieci. W analizowanej grupie było: 21 pacjentów z przewlekłym zapaleniem wątroby (PZW) (13 dziewcząt i 8 chłopców, w wieku od 6,0 do 18,0 lat, średni wiek 13,0±3,0 lat, mediana 13,0 lat):

– 10 dzieci z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu B (HBV),

– 4 dzieci z przewlekłym wirusowym zapaleniem wątroby typu C (HCV),

– 7 dzieci z przewlekłym autoimmunologicznym zapaleniem wątroby (AIH).

Grupę kontrolną (porównawczą) (K) stanowiło 42 dzieci: 20 dziewcząt i 22 chłopców, w wieku od 2,0 do 18,0 lat (średni wiek 11,0±5,0 lat, mediana 11,0 lat), u których wykonywane badania diagnostyczne pozwoliły wykluczyć: stan zapalny, zaburzenia immunologiczne, zaburzenia odżywienia oraz choroby nowotworowe. Badani w okresie 6 miesięcy poprzedzających oznaczenia nie przyjmowali preparatów immunomodujących. Grupę tę wykorzystano jako porównawczą do analizy oznaczeń wykonywanych we krwi obwodowej.

U wszystkich badanych wykonywano następujące rutynowe oznaczenia laboratoryjne: liczba białych krwinek (WBC), liczba płytek krwi (PLT), odczyn opadania erytrocytów (OB), poziom białka całkowitego (B. całk.), poziom białka C-reaktywnego (CRP), aktywność aminotransferazy alaninowej (ALT) i asparaginowej (AST) oraz fosfatazy alkalicznej (Falk) i gamma-glutamylotrans-
peptydazy (GGTP).

Stężenie TGF-β1 w osoczu oznaczano przy pomocy komercyjnego zestawu opartego na technice sandwich ELISA (Quantikine, R&D systems, Minneapolis, MN, USA) ściśle wg zaleceń producenta.

Ślepą biopsję wątroby wykonywano w krótkotrwałym znieczuleniu ogólnym, materiał tkankowy pobierano przy pomocy igły Hepafix 1,2-1,4 (Braun, Melsungen, Niemcy).

Z części bioptatów, po utrwaleniu w formalinie wykonano preparaty histologiczne. W badanych bioptatach wątroby, zgodnie z zaleceniami Światowego Kongresu Gastroenterologów, oddzielnie, w skali punktowej od 0 do 4, oceniano aktywność zmian zapalnych (grading) i zaawansowanie włóknienia (staging) (8).

Obecność TGF-β1 w bioptatach wątroby oceniano immunohistochemicznie (Vectastain ABC Kit, PK-4001, Vector Laboratories, USA ABC). Aktywność endogennej peroksydazy blokowano preinkubując skrawki 30 minut z 0,3% roztworem nadtlenku wodoru. Niespecyficzne wiązanie przeciwciał blokowano przez inkubację skrawków z roztworem surowicy koziej. Skrawki inkubowano z roztworem 1:50 króliczych przeciwciał anty-TGF-β1 (sc-146, Santa Cruz Biotechnology, USA) przez 24 godz. w temp. 4oC, a po płukaniu w PBS inkubowano przez 1,5 godz. z kozim wtórnym biotynylowanym przeciwciałem przeciwkróliczym w rozcieńczeniu 1:100 (Vectastain ABC Kit). Powstałe kompleksy antygen-przeciwciała uwidaczniano po godzinnej inkubacji z kompleksem awidyny i biotynylowanej peroksydazy i zabarwieniu komórek immunoreaktywnych przy użyciu 3,3-diaminobenzydyny (DAB, ICN Biomedicals Inc., USA). Preparaty oceniano przy końcowych powiększeniach 200× i 400× w sposób półilościowy (słabe, średnio intensywne i maksymalne nasilenie reakcji IHC wyrażano w skali
od 1+ do 3+).

Wykrywanie obecności i oznaczanie poziomu mRNA genu kodującego TGF-β1 w bioptatach wątroby metodą odwrotnej transkrypcji i łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym (Real-Time PCR) przeprowadzono w następujących etapach:

1.    Izolacja RNA przy użyciu zestawu ,,Total RNA Prep Plus” (A&A Biotechnology, Polska) według instrukcji producenta. Stężenie i czystość wyizolowanego RNA określano metodą spektrofotometryczną, wykorzystując urządzenie Smart SpecTM3000 (Bio-Rad, USA).

2.    Reakcja odwrotnej transkrypcji

3.    Oznaczanie ilości transkryptu metodą PCR w czasie rzeczywistym.

Do przeprowadzenia analizy wykorzystano zestaw iQSybrGreen Supermix® (Bio-Rad, USA), zawierający 50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH=8,4; 0,2 mM DTP, 0,025 jednostki/µl polimerazy Taq, 3 mM MgCl2, Sybr Green i 20 nM fluoresceiny. Używano aparatu iCyclerIQ Multicolor Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA) oraz 96-dołkowych (0,2 ml) płytek typu „non-skirted” do reakcji PCR w czasie rzeczywistym (BIOplastic, Holandia).

W celu oznaczenia względnej ilości mRNA genu TGF-β1, uzyskany wynik porównywano z analogiczną reakcją dla transkryptu β-aktyny. Ostatecznie obliczenia poziomu ekspresji genu TGF-β1 dokonano w stosunku do mRNA β-aktyny (bact) wg następującego wzoru: TGF-β /bact% = 2-∆Ct x 100%, gdzie ∆Ct=CtTGF-β – Ctbact. (9). Celem uproszczenia, w dalszych etapach pracy dla oznaczenia wyników powyższych badań zastosowano określenie: poziom mRNA genu TGF-β1.

Uzyskane dane poddano analizie statystycznej. Do analizy wykorzystano testy nieparametryczne: test Manna-Whitney’a do porównania dwóch grup, test ANOVA Kruskal-Wallisa do porównania wielu grup oraz test korelacji rang Spearmana. Do porównania parametrów jakościowych wykorzystano test Persona χ2 wprowadzając poprawkę Yatesa, gdy liczebność podgrupy była mniejsza od 10. W wynikach analiz podano obliczony poziom istotności statystycznej (p); wartości p<0,05 interpretowano jako znamienne statystycznie. Obliczenia wykonano z użyciem pakietu oprogramowania Statistica 7 (StatSoft Inc., USA).

Na przeprowadzenie powyższych badań uzyskano zgodę Niezależnej Komisji Bioetycznej do Spraw Badań Naukowych przy Uniwersytecie Medycznym w Gdańsku (NKEBN/13/2004).

WYNIKI

Wartości stężenia TGF-β1 w osoczu w badanych grupach dzieci wahały się od 0,11 do 55,10 ng/ml. Szczegółowe dane przedstawiono w tabeli I.

Porównanie średnich wartości stężenia TGF-β1 w osoczu pomiędzy grupami PZW i K nie wykazało statystycznie istotnej różnicy (p=0,06). Nie obserwowano także istotnej różnicy stężenia TGF-β1 w osoczu między badanymi podgrupami chorych (AIH, HCV, HBV) (p=0,59).

Analizując zależność stężenia TGF-β1 w osoczu od parametrów laboratoryjnych stwierdzono istotną dodatnią korelację z aktywnością GGTP zarówno w grupie badanej, jak i w grupie kontrolnej (odpowiednio: RS=0,51, p=0,02 oraz RS=0,72, p=0,02).

Nie obserwowano istotnej zależności między stężeniem TGF-β1 w osoczu a aktywnością zapalną (grading) (Rs=0,25; p=0,27) ani nasileniem włóknienia (staging) (Rs=0,16; p=0,49) stwierdzonym w badaniu histopatologicznym wycinków wątroby.

Badanie immunohistochemiczne (IHC) na obecność TGF-β1 wykazało małe nasilenie reakcji (1+) u 14 badanych, a średnie nasilenie reakcji (2+) u 7 chorych dzieci z PZW. U żadnego z pacjentów nie stwierdzono dużego nasilenia reakcji IHC (3+). Nasilenie reakcji ICH na obecność TGF-β1 nie różniło się istotnie w poszczególnych podgrupach chorych z PZW (AIH, HBV i HCV: p=0,21).

Nie obserwowano istotnej różnicy wartości stężenia TGF-β1 w osoczu w zależności od nasilenia reakcji IHC na obecność TGF-β1 w tkance wątrobowej (p=0,36).

W badanej grupie pacjentów z PZW nie wykazano istotnej zależności między nasileniem reakcji IHC na obecność TGF-β1 a aktywnością zapalną (grading) (RS=0,22, p=0,67) ani nasileniem włóknienia (staging) (RS= –0,49, p=0,32) w badaniu histopatologicznym wycinków wątroby.

Poziom mRNA genu kodującego TGF-β1 w bioptatach wątroby badany w czasie rzeczywistym (Real-Time PCR) przedstawiono w tabeli II.

Nie wykazano istotnych różnic między poziomami mRNA genu kodującego TGF-β1 w poszczególnych podgrupach chorych z PZW (AIH, HBV i HCV: p=0,63).

Analizując zależność między poziomem mRNA genu TGF-β1 w bioptacie wątroby a badanymi parametrami laboratoryjnymi wykazano dodatnią korelację między poziomem mRNA genu TGF-β1 a wartością OB (RS=0,79, p=0,002) oraz aktywnością ALT (R=0,60, p=0,02).

Nie odnotowano statystycznie istotnej zależności miedzy poziomem mRNA genu TGF-β1 a aktywnością zapalną (grading) (Rs= –0,31; p=0,28) ani nasileniem włóknienia (staging) (Rs= –0,27; p=0,34) stwierdzonym w badaniu histopatologicznym wycinków wątroby.

U chorych z PZW nie wykazano istotnej korelacji stężenia TGF-β1 w osoczu z poziomem mRNA genu TGF- β1 badanym w tkance wątrobowej (Rs= –0,23; p=0,43).

Nie obserwowano także statystycznie istotnej różnicy poziomu mRNA genu TG-β1 w zależności od nasilenia reakcji immunohistochemicznej IHC w tkance wątrobowej (p=0,35).

OMÓWIENIE WYNIKÓW I DYSKUSJA

W związku z tym, że TGF-β1 bierze udział w tworzeniu macierzy pozakomórkowej oraz aktywnie uczestniczy w procesach naprawczych, interesująca wydaje się ocena poziomu tej cytokiny u pacjentów z przewlekłymi zapaleniami wątroby, w przebiegu których, jak wiadomo, może dojść do włóknienia, a następnie rozwoju marskości wątroby (7). Najwięcej danych z piśmiennictwa dotyczy zachowania się TGF-β1 u pacjentów z przewlekłymi wirusowymi zapaleniami wątroby typu C i B (5, 6, 10, 11, 12, 13). Zdecydowana większość doniesień podkreśla znamiennie wyższy poziom TGF-β1 w osoczu u tych chorych w porównaniu z grupą kontrolną (10, 12, 14, 15).

Część autorów obserwowała także spadek poziomu tej cytokiny we krwi u chorych, którzy pozytywnie odpowiedzieli na terapię przeciwwirusową (15). Tsushima i wsp. w grupie 43 pacjentów z PZW typu C przed rozpoczęciem leczenia interferonem α stwierdzili znamiennie wyższe poziomy TGF-β1 w porównaniu z grupą kontrolną. Retrospektywnie wykazali także, że stężenie TGF-β1 w osoczu badane w chwili zakończenia terapii różniło się znamiennie w zależności od ostatecznego wyniku leczenia. W grupie chorych, u których uzyskano długotrwałą, pozytywną odpowiedź na leczenie, stężenie badanej cytokiny było znamiennie niższe niż u pacjentów, którzy nie wyeliminowali HCV bądź u których doszło do nawrotu choroby (16).

Podobnie u chorych z PZW typu B większość autorów obserwowała wyższy poziom tej cytokiny w osoczu w porównaniu z grupą kontrolną (10). Murawaki i wsp. stwierdzili natomiast, że podwyższenie poziomu TGF-β1 w surowicy występuje u chorych z PZW jedynie w przypadku nasilonych zmian histologicznych (aktywność zapalna i włóknienie), nie widząc podobnej zależności w przypadku zmian minimalnych (17). Szereg doniesień podkreśla wyraźny związek osoczowego poziomu TGF-β1 z nasileniem włóknienia w wątrobie (6, 10, 11, 16, 17, 18).

Natomiast Marek i wsp., na podstawie przeprowadzonych badań w grupie 75 chorych z PZW o etiologii wirusowej, wysunęli wniosek, że poziom TGF-β1 w osoczu dobrze koreluje nie tylko z nasileniem włóknienia, ale także z aktywnością zapalną w tkance wątrobowej (14). Według niektórych autorów, stałe utrzymywanie się podwyższonego poziomu TGF-β1 w osoczu u pacjentów z PZW może być wartościowym wskaźnikiem przy kwalifikowaniu chorych do leczenia (6). Ponadto badania przeprowadzone u dorosłych chorych zmarskością wątroby wykazały, że poziom TGF-β1 w osoczu koreluje dodatnio ze skalą Child-Pugh (19) i poziomem bilirubiny oraz ujemnie z poziomem albumin w surowicy krwi (12). Daje to nadzieje na wykorzystane tego parametru, jako dodatkowego wskaźnika pogarszającej się wydolności wątroby.

W badanej grupie dzieci z PZW przeprowadzono szczegółową analizę poziomu TGF-β1 w osoczu, nie wykazując różnic w porównaniu z grupą kontrolną ani w zależności od etiologii zapalenia wątroby. Nie stwierdzono ponadto zależności między poziomem badanej cytokiny a aktywnością zapalną czy nasileniem włóknienia w wątrobie. Badana grupa dzieci była jednak nieliczna i u większości pacjentów stwierdzano mało nasilone włóknienie. Doniesienia na temat znaczenia oznaczania poziomu TGF-β1 w osoczu w PZW dzieci nie są tak jednoznaczne jak u dorosłych. Lebensztejn i wsp. badając dzieci z PZW typu B wykazali znamiennie wyższy poziom TGF-β1 w osoczu u chorych w porównaniu z grupą kontrolną. W odróżnieniu od danych uzyskanych u dorosłych, w tej grupie badanych nie wykazano różnic w poziomie tej cytokiny w zależności od wyniku leczenia interferonem α ani korelacji z nasileniem włóknienia w wątrobie (13, 20, 21).

Wielu autorów poszukiwało ewentualnej zależności między poziomem tej cytokiny w osoczu a biochemiczymi markerami uszkodzenia wątroby. Doniesienia na ten temat są rozbieżne. Zdecydowanie przeważa opinia (także dla populacji pediatrycznej), że brak jest korelacji między tymi parametrami (6, 18, 19, 20, 21). Flisiak i wsp. u pacjentów z PZW typu C wykazali korelacje jedynie między poziomem TGF-β1 w osoczu a aktywnością amiotransferazy asparaginianowej (22). Dla analizowanych w niniejszej pracy parametrów biochemicznych, w całej grupie badanych dzieci z PZW, stwierdzono istotną zależność jedynie między poziomem TGF-β1 w osoczu a aktywnością GGTP w surowicy krwi.

Doniesienia na temat zachowania się TGF-β1 w osoczu u pacjentów z autoimmunologicznym zapaleniem wątroby (AIH) zdecydowanie podkreślają znamiennie wyższy jego poziom w aktywnym okresie choroby w porównaniu z grupą kontrolną i wynikami uzyskanymi w okresie remisji choroby (23, 24). Jednak w badanej grupie 7 pacjentów z i typem AIH w aktywnym okresie choroby nie wykazano różnic w poziomie TGF-β1 w osoczu w porównaniu z grupą kontrolną i pacjentami, u których rozpoznano PZW o etiologii wirusowej. Nie wykazano także zależności między poziomem TGF-β1 w osoczu, nasileniem reakcji immunohistochemicznej oraz poziomem mRNA genu kodującego TGF-β1 w tkance wątrobowej. Bayer i wsp. w okresie aktywnym choroby stwierdzili nie tylko znacznie podwyższony poziom TGF-β1 w osoczu, ale również silną jego ekspresję miejscową w zmienionej zapalnie tkance wątrobowej. Wykazali ponadto obniżanie się obu parametrów wraz z remisją choroby. Nie stwierdzono natomiast tak wyraźniej zależności między tkankową ekspresją TGF-β1 a biochemicznymi markerami aktywności choroby (23). Przyczyna opisanych zmian nie jest ostatecznie wyjaśniona. Bierze się pod uwagę możliwość spontanicznej immunosupresji ustroju mającej na celu korektę własnych zaburzeń autoimmunologicznych. Wiadomo bowiem, że TGF-β1 ma niezwykle silne działanie immunosupresyjne. Być może wysoki poziom tej cytokiny obserwowany u nieleczonych pacjentów jest wyrazem naturalnego, ochronnego działania ustroju (25).

TGF-β1 wydaje się być podstawowym czynnikiem odpowiedzialnym za włóknienie wątroby, między innymi poprzez hamowanie degradacji białek wchodzących w skład ECM. TGF-β1 może stymulować także niektóre białka ECM (fibronektyna, kolagen), aktywować typ I kolagenu oraz nasilać jego sekrecję przez komórki gwiaździste (26). Biorąc pod uwagę powyższe właściwości TGF-β1, obserwowany przez wielu autorów spadek jego stężenia we krwi w trakcie leczenia u pacjentów z PZW wydaje się pozytywnym czynnikiem prognostycznym.

Interesujące są doniesienia Tsai i wsp. na temat oceny poziomu TGF-β1 w moczu u pacjentów z PZW typu C i u chorych z rakiem wątrobowokomórkowym na tle marskości wątroby. Autorzy wykazali znamienną, dodatnią korelację poziomu tej cytokiny w moczu z przebiegiem choroby. U pacjentów z marskością wątroby stężenie TGF-β1 w moczu było znamiennie wyższe niż u pacjentów z PZW bez cech marskości, obserwowano także wyraźną zależność poziomu tej cytokiny od klasyfikacji Child-Pugh (27).

W pracy niniejszej, poza oznaczeniem stężenia TGF-β1 w osoczu w badanej grupie pacjentów z PZW, oceniano również miejscową ekspresję TGF-β1. Badanie immnohistochemiczne (IHC) wykazało stosunkowo słabo nasiloną reakcję na obecność TGF-β1 w tkance wątrobowej. Wydaje się, że można to tłumaczyć niewielkim nasileniem włóknienia obserwowanym w badanej grupie dzieci z PZW. Nie wykazano również korelacji między ekspresją TGF-β1 ocenianą metodą immunohistochemiczną a aktywnością zapalną i zaawansowaniem włóknienia w wątrobie. Dostępne dane z piśmiennictwa na ten temat dotyczą jedynie dorosłych, u których nasilenie włóknienia jest zwykle większe, co w przypadku wirusowych zapaleń wątroby jest skutkiem przede wszystkim dłuższego czasu trwania choroby. Kinnman i wsp. oceniając nasilenie reakcji immunohistochemicznej w tkance wątrobowej u nieleczonych chorych z PZW typu C, wykazali w ogniskach nasilonego zapalenia i włóknienia wzmożoną ekspresję wszystkich trzech izoform TGF-β oraz białka transportującego latentną postać tej cytokiny (LTPB), sugerując udział w patogenezie wszystkich izoform, a nie tylko TGF-β1 (28). W badaniach własnych oceniano w tkankach jedynie ekspresję TGF-β1. Być może jednoczesna analiza zachowania się również pozostałych dwóch izoform TGF-β1 pozwoliłaby na dokładniejszą ocenę udziału tej cytokiny w patogenezie PZW. Inna grupa badaczy u większości chorych z PZW typu C wykazała wprawdzie obecność TGF-β1 w komórkach zatokowych, nie obserwując jednak, podobnie jak w niniejszej pracy, korelacji między jego ekspresją a zmianami histopatologicznymi w tkance wątrobowej. Interesującym jest fakt, iż u tych samych chorych obserwowali oni korelację między poziomem TGF-β1 w osoczu a stopniem włóknienia wątroby (18). Natomiast u pacjentów z AIH Bayer i wsp. w aktywnej fazie choroby wykazali silną ekspresję TGF-β1 nie tylko w najbliższym sąsiedztwie nacieków zapalnych, lecz również w obszarze bardziej odległym w obrębie zrazika (23). W badaniach własnych, oceniając poziom mRNA genu kodującego TGF-β1 w bioptatach wątr
oby metodą odwrotnej transkrypcji i łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym (Real-Time PCR), również nie wykazano różnic między chorymi z PZW a grupą kontrolną.

Interesujące są wyniki badań autorów polskich, którzy badali zależność średniego dobowego stężenia TGF-β1 w surowicy i ilościowej oceny mRNA genu kodującego TGF-β1 w bioptatach wątroby u chorych z PZW typu B. Wykazano wyższy poziom mRNA w tkance chorych z PZW typu B w porównaniu z grupą kontrolną. U pacjentów z włóknieniem wątroby ocenionym jako średnie lub nasilone nie obserwowano korelacji między stężeniem tej cytokiny we krwi a poziomem mRNA genu kodującego TGF-β1 w tkance wątrobowej. Stwierdzono ją natomiast u osób, u których w wątrobie wykazano zmiany minimalne (29). W badaniach własnych nie wykazano podobnej zależności, mimo że w analizowanej grupie dzieci również nie obserwowano nasilonego włóknienia wątroby. Nie stwierdzono także korelacji między aktywnością zapalną a poziomem mRNA genu kodującego TGF-β1 w tkance wątrobowej.

W badanej grupie dzieci z PZW nie znaleziono zależności między poziomem TGF-β1 w osoczu a wynikami badania immunohistochemicznego i molekularnego na obecność TGF-β1. Dla całej populacji badanych dzieci z PZW wykazano natomiast dodatnią korelację poziomu mRNA genu kodującego TGF-β1 w tkance wątrobowej z aktywnością ALT oraz wartością OB. Wskazywać to może na udział TGF-β1 w inicjowaniu i podtrzymywaniu reakcji zapalnej u chorych z PZW. Wydaje się jednak, że na podstawie uzyskanych wyników nie można wyciągać ogólnych wniosków. Ograniczenia powyższe wynikają przede wszystkim z niewielkiej liczby dzieci z PZW, co utrudnia analizowanie wyników badań w grupach PZW o różnej etiologii. Być może brak zależności między osoczowym stężeniem TGF-β1 i jego miejscową ekspresją badaną metodą immunohistochemiczną i molekularną a zmianami histopatologicznymi jest również wynikiem niewielkiej aktywności zapalnej i niewielkiego nasilenia włóknienia w badanych bioptatach wątroby. Większość doniesień z piśmiennictwa dotyczących chorych z PZW podkreśla przede wszystkim związek ekspresji TGF-β1 z procesem włóknienia, zwłaszcza w stadiach zaawansowanych. Podstawowym utrudnieniem w interpretowaniu wyników badań uzyskanych z materiału tkankowego (biopsja wątroby) był brak grupy kontrolnej w aspekcie wyników badań ocenianych w tkance wątrobowej. Obiektywną grupę kontrolną dla chorych z PZW stanowiłyby osoby, u których nie stwierdza się cech patologii wątroby ani dróg żółciowych. Jednak w związku z tym, że biopsja wątroby jest badaniem inwazyjnym, obarczonym licznymi, często poważnymi powikłaniami, z przyczyn etycznych nawet nie podejmowano starań o jej utworzenie. Wyniki oceny TGF-β1 w tkance wątrobowej mogłyby natomiast być wykorzystane u poszczególnych chorych do monitorowania przebiegu choroby (głównie włóknienia) oraz ustalenia wskazań do wdrożenia leczenia.

Należy także pamiętać, że do pełnej oceny działania TGF-β1 niezbędne jest zbadanie wszystkich elementów uczestniczących w prawidłowej jego syntezie, aktywacji oraz przekazywaniu sygnału do komórki i w jej wnętrzu. Szereg doniesień podkreśla znaczenie mutacji genu kodującego TGF-β1, zaburzeń na poziomie receptorów dla tej cytokiny, białek biorących udział w jego aktywacji czy nieprawidłowości w zakresie układu białek przekazujących/hamujących sygnał wewnątrzkomórkowo (białka z rodziny Smad) (30, 31).

Być może wszechstronne badanie nie jednej, wybranej cytokiny, ale całego profilu cytokin uczestniczących w patogenezie PZW, pozwoliłoby na wyciągnięcie bardziej ogólnych wniosków.

WNIOSKI

1.    Poziom TGF-β1 w osoczu u pacjentów z PZW nie odzwierciedla aktywności zapalnej ani nasilenia włóknienia w tkance wątrobowej – co może wynikać z niewielkiego nasilenia włóknienia obserwowanego u dzieci.

2.    Wydaje się, że miejscowa ekspresja TGF-β1 oceniana w wycinkach wątroby u chorych z PZW nie powinna być traktowana jako jeden z czynników różnicujących ani monitorujących przebieg PZW u dzieci.

3.    U dzieci z PZW analiza poziomu mRNA genu kodującego TGF-β1 w wycinkach wątroby ani miejscowa ekspresja TGF-β1 nie wydają się być przydatne w różnicowaniu i ocenie nasilenia zmian morfologicznych.

4. Wobec stosunkowo niewielkiej liczebności analizowanych grup, wskazane wydaje się przeprowadzenie analogicznych, kompleksowych badań w większych populacjach pacjentów z PZW.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Letterio J.J., Roberts A.B.: Regulation of immune responses by TGF-β. Annu. Rev. Immunol., 1998, 16, 137-161.

2.    Wahl S.M.: Transforming Growth Factor β: The Good, the Bad and the Ugly. J. Exp. Med., 1994, 180, 1587-1590.

3.    Fujii D., Brissenden J.E., Derynck R., Francke U.: Transforming growth factor beta gene maps to human chromosome 19 long arm and to mouse chromosome 7. Somat. Cell Mol. Genet., 1986,  12(3),  281-288.

4.    Flisiak R., Prokopowicz D.: Transforming growth factor-beta1 as a surrogate marker of hepatic dysfunction in chronic liver diseases. Clin. Chem. Lab. Med., 2000, 38(11), 1129-1131.

5.    Castilla A., Prieto J., Fausto N.: Transforming growth factors beta 1 and alpha in chronic liver disease. Effects of interferon alfa therapy. N. Engl. J. Med., 1991, 324(14), 933-940.

6.    Kanzler S., Baumann M., Schirmacher P., Dries V., Bayer E., Gerken G., Dienes H.P., Lohse A.W.: Prediction of progressive liver fibrosis in hepatitis C infection by serum and tissue levels of transforming growth factor-beta. J. Viral. Hepatol., 2001, 8(6), 430-437.

7.    Mazur W., Gonciarz M., Gonciarz Z.: Włóknienie wątroby – aspekty kliniczne. Med. Dypl., 2003, 10, 30-38.

8.    International Working Party. Terminology of chronic hepatitis. Am. J. Gastroenterol., 1995, 90, 181-189.

9.    Lutfalla G., Uze G.: Performing quantitative reverse-transcribed polymerase chain reaction experiments. Methods. Enzymol., 2006, 410, 386-400.

10.    Flisiak R., Al-Kadasi H., Jaroszewicz J., Prokopowicz D., Flisiak I.: Effect of lamivudine treatment on plasma levels of transforming growth factor beta1, tissue inhibitor of metalloproteinases-1 and metalloproteinase-1 in patients with chronic hepatitis B. World J. Gastroenterol., 2004, 10(18), 2661-2665.

11.    Janczewska-Kazek E., Marek B., Kajdaniuk D., Borgiel-Marek H.: Effect of interferon alpha and ribavirin treatment on serum levels of transforming growth factor-beta1, vascular endothelial growth factor, and basic fibroblast growth factor in patients with chronic hepatitis C. World J. Gastroenterol., 2006, 12(6), 961-965.

12.    Kirmaz C., Terzioglu E., Topalak O., Bayrak P., Yilmaz O., Ersoz G., Sebik F.: Serum transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) in patients with cirrhosis, chronic hepatitis B and chronic hepatitis C. Eur. Cytokine. Netw., 2004, 15(2), 112-116.

13.    Lebensztejn D.M., Skiba E., Kaczmarski M., Werpachowska I., Sobaniec-Łotowska M.: The serum concentration of transforming growth factor beta1, interleukin 12 and interleukin 5 in children with chronic hepatitis B. Pol. Merkur. Lek., 2003, 15(85), 86-88.

14.    Marek B., Kajdaniuk D., Janczewska-Kazek E., Beniowski M., Swietochowska E., Kos-Kudła B., Ostrowska Z., Mazurek U., Wilczok T., Nowak M., Siemińska L., Borgiel-Marek H., Strzyzewski A., Januła A., Sierek K., Niedzielski Z.: Stężenia aminoterminalnego propeptydu prokolagenu typu III (PIIINP) oraz transformującego czynnika wzrostu-β1 (TGF-β1) we krwi obwodowej chorych z przewlekłym zapaleniem wątroby typu B i C. Pol. Arch. Med. Wewn., 2003, 109(6), 603-608.

15.    Mazur W., Braczkowski R., Gonciarz M., Petelentz M., Mazurek U., Wilczok T., Gonciarz Z.: Fibrosis TGF-β1 marker in blood of chronic hepatitis C patients during interferon alfa-2B therapy. Med. Sci. Monit., 1999, 5(Suppl. 1), 73-76.

16.    Tsushima H., Kawata S., Tamura S., Ito N., Shirai Y., Kiso S., Doi Y., Yamada A., Oshikawa O., Matsuzawa Y.: Reduced plasma transforming factor-β1 levels in patients with chronic hepatitis C after interferon-α therapy: association with regression of hepatic fibrosis. J. Hepatol., 1999, 30, 1-7.

17.    Murawaki Y., Nishimura Y., Ikuta Y., Idobe Y., Kitamura Y., Kawasaki H.: Plasma transforming growth factor-beta 1 concentrations in patients with chronic viral hepatitis. J. Gastroenterol. Hepatol., 1998, 13(7), 680-684.

18.    Nelson D.R., Gonzalez-Peralta R.P., Qian K., Xu Y., Marousis C.G., Davis G.L., Lau J.Y.: Transforming growth factor-beta 1 in chronic hepatitis C. J. Viral. Hepat., 1997, 4(1), 29-35.

19.    Flisiak R., Pytel-Krolczuk B., Prokopowicz D.: Circulating transforming growth factor beta (1) as an indicator of hepatic function impairment in liver cirrhosis. Cytokine, 2000, 12(6), 677-681.

20.    Lebensztejn D.M., Sobaniec-Lotowska M., Kaczmarski M., Werpachowska I., Sienkiewicz J.: Serum concentration of transforming growth factor (TGF)-beta 1 does not predict advanced liver fibrosis in children with chronic hepatitis B. Hepato-gastroenterology, 2004, 51(55), 229-233.

21.    Lebensztejn D.M., Sobaniec-Lotowska M.E., Kaczmarski M., Voelker M., Schuppan D.: Matrix-derived serum markers in monitoring liver fibrosis in children with chronic hepatitis B treated with interferon alpha. World J. Gastroenterol., 2006, 12(21), 3338-3343.

22.    Flisiak R., Jaroszewicz J., Lapinski T.W., Flisiak I., Prokopowicz D.: Effect of pegylated interferon alpha 2b plus ribavirin treatment on plasma transforming growth factor-beta1, metalloproteinase-1, and tissue metalloproteinase inhibitor-1 in patients with chronic hepatitis C. World J. Gastroenterol., 2005, 11(43), 6833-6838.

23.    Bayer E.M., Herr W., Kanzler S., Waldmann C., Meyer Zum Büschenfelde K.H., Dienes H.P., Lohse A.W.: Transforming growth factor-beta1 in autoimmune hepatitis: correlation of liver tissue expression and serum levels with disease activity. J. Hepatol., 1998, 28(5), 803-811.

24.    Sakaguchi K., Kitano M., Nishimura M., Senoh T., Ohta T., Terao M., Shinji N., Koide N., Tsuji T.: Serum level of transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) and the expression of TGF-beta receptor type II in peripheral blood mononuclear cells in patients with autoimmune hepatitis. Hepatogastroenterology, 2004, 51(60), 1780-1783.

25.    Lohse A.W., Kögel M., Meyer zum Büschenfelde K.H.: Evidence for spontaneous immunosuppression in autoimmune hepatitis. Hepatology, 1995, 22(2), 381-388.

26.    Kweon Y.O., Goodman Z.D., Dienstag J.L., Schiff E.R., Brown N.A., Burchardt E., Schoonhoven R., Brenner D.A., Fried M.W.: Decreasing fibrogenesis: an immunohistochemical study of paired liver biopsies following lamivudine therapy for chronic hepatitis B. J. Hepatol., 2001, 35(6), 749-755.

27.    Tsai J.F., Jeng J.E., Chuang L.Y., Chang W.Y., Tsai J.H.: Urinary transforming growth factor beta1 levels in hepatitis C virus-related chronic liver disease: correlation between high levels and severity of disease. Hepatology, 1997, 25(5), 1141-1146.

28.    Kinnman N., Andersson U., Hultcrantz R.: In situ expression of transforming growth factor-beta1-3, latent transforming growth factor-beta binding protein and tumor necrosis factor-alpha in liver tissue from patients with chronic hepatitis C. Scand. J. Gastroenterol., 2000, 35(12), 1294-1300.

29.    Marek B., Kajdaniuk D., Mazurek U., Janczewska-Kazek E., Strzałka B., Beniowski M., Kos-Kudła B., Kajdaniuk J., Niedziołka D., Ostrowska Z., Borgiel-Marek H., Siemińiska L., Nowak M., Pakuła D., Gatnar A., Gnot R., Filipczyk P.: Ocena ilościowa mRNA TGF-β1 w bioptacie wątroby w powiązaniu ze średniodobowym stężeniem TGF-β1 w surowicy u chorych z przewlekłym zapaleniem wątroby typu B Pol. Arch. Med. Wewn., 2005, 114(2), 738-745.

30.    Monteleone G., Kumberova A., Croft N.M., McKenzie C., Steer H.W., MacDonald T.T.: Blocking Smad7 restores TGF-beta1 signaling in chronic inflammatory bowel disease. J. Clin. Invest., 2001,  108(4), 601-609.

31.    Okamura J., Hara T.: Polymorphisms of transforming growth factor-beta1 and transforming growth factor-beta1 type II receptor genes are associated with acute graft-versus-host disease in children with HLA-matched sibling bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant., 2002, 30(10), 665-671.

..............................................................................................................................................................

Adres do korespondencji:

Anna Liberek
Katedra i Klinika Pediatrii,
Gastroenterologii,
Hepatologii i Żywienia Dzieci
Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego
ul. Nowe Ogrody 1/6, 80-803 Gdańsk
tel./fax (0-58) 302-25-91
alib@amg.gda.pl