WSTĘP

Spośród wszystkich infekcji bakteryjnych zakażenia Streptococcus pneumoniae są według WHO najczęstszą przyczyną chorób i zgonów u dzieci. Szacuje się, że co roku z ich powodu umiera rocznie na świecie około 2 mln dzieci poniżej 5 r.ż. (1).

Do najczęstszych chorób wywoływanych przez szczepy Streptococcus pneumoniae należą zakażenia w obrębie dróg oddechowych jak ostre zapalenie ucha środkowego, zapalenie zatok, odoskrzelowe zapalenie płuc oraz zakażenia inwazyjne. Te ostatnie, określane także mianem inwazyjnej choroby pneumokokowej (IChP), takie jak posocznica, bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych (BZOMR), zapalenie płuc z bakteriemią, zapalenie otrzewnej, charakteryzują się częstymi i poważnymi powikłaniami oraz wysoką śmiertelnością (2).

W USA prawie każde dziecko do 5 r.ż. ma za sobą przebyte zapalenie ucha środkowego wywołane przez pneumokoki. Natomiast w krajach rozwijających się gatunek ten jest najczęstszym czynnikiem etiologicznym pozaszpitalnych zapaleń płuc zarówno u dzieci jak i dorosłych (3). Posocznica może występować niezależnie od zapalenia płuc a śmiertelność w jej przebiegu jest podobna do opisywanej dla pneumokokowego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i wynosi 17-25%.
S. pneumoniae jako czynnik etiologiczny BZOMR dużo częściej wywołuje poważne powikłania niż inne bakterie i może odpowiadać za nawrotowe BZOMR. Najwięcej inwazyjnych zachorowań występuje w skrajnych grupach wiekowych, tj. u dzieci do 2 r.ż. oraz u osób powyżej 65 r.ż. (4-6).

Prawie wszystkie kliniczne izolaty S. pneumoniae posiadają otoczkę, która zabezpiecza je przed fagocytozą, a przeciwciała skierowane przeciw wielocukrom otoczki zapewniają typowo-swoistą odporność (5). Na podstawie właściwości antygenowych otoczek pneumokoki podzielono na ponad 90 typów serologicznych (7, 8). Tak duża liczba serotypów uniemożliwia opracowanie koniugowanej szczepionki na bazie oczyszczonych typowych wielocukrów, skutecznej przeciw wszystkim z nich. Od roku 1983 dostępna jest 23-walentna szczepionka polisacharydowa (Pneumo 23 i Pneumovax 23), zalecana w grupach podwyższonego ryzyka zakażenia pneumokokami, którą można stosować powyżej 2 r.ż. W badaniach obserwowano zróżnicowaną skuteczność, aczkolwiek meta-analiza przeprowadzona na podstawie 9 randomizowanych kontrolowanych badań klinicznych wykazała, że szczepionka ta jest skuteczna w zmniejszaniu liczby przypadków pneumokokowego zapalenia płuc przebiegającego bez bakteriemii jedynie wśród osób dorosłych z grup niskiego ryzyka, ale nie w grupach wysokiego ryzyka (9). Wyniki badań epidemiologicznych wykazały, że za większość zakażeń inwazyjnych u małych dzieci, odpowiadają szczepy należące do niektórych typów serologicznych. Dlatego postanowiono opracować szczepionkę, która byłaby immunogenna w tej grupie wiekowej oraz pokrywała swym spektrum większość tzw. inwazyjnych serotypów, do których często należą szczepy oporne już nie tylko na jeden, ale na kilka grup antybiotyków (tzw. szczepy wielooporne). Takie warunki spełnia 7-walentna skoniugowana szczepionka przeciwpneumokokowa (7vPCV, Prevenar), zawierająca polisacharydy otoczkowe serotypów 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F i 23F, skoniugowane z białkiem nośnikowym, toksoidem błoniczym, skuteczna u dzieci od 2 miesiąca życia.

W Polsce nie ma wielu danych dotyczących częstości występowania IChP wśród dzieci, a tym bardziej brak jest danych o typach serologicznych pneumokoków odpowiedzialnych za zakażenia inwazyjne. Poza tym obserwuje się duże różnice w występowaniu serotypów w poszczególnych krajach, w krajach wysoko uprzemysłowionych i tych mniej uprzemysłowionych, a także pomiędzy rodzajami zakażeń, jakie wywołują. Obserwowane regionalne różnice oraz zmieniająca się sytuacja epidemiologiczna nawet na przestrzeni krótkiego czasu przemawiają za koniecznością monitorowania serologicznego szczepów.

CEL PRACY

Celem niniejszej pracy było określenie udziału szczepów pneumokokowych o serotypach będących w spektrum działania 7-walentnej szczepionki przeciw pneumokokowej (7vPCV) wśród przypadków inwazyjnej choroby pneumokokowej (IChP) w Małopolsce w latach 2000-2008.

MATERIAŁ I METODY

Do badania włączono wszystkie szczepy Streptococcus pneumoniae wyhodowane od chorych poniżej 15 roku życia z IChP z województwa małopolskiego od początku 2000 do połowy 2008 r. i przesłane do dalszych badań do Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Diagnostyki Bakteryjnych Zakażeń Ośrodkowego Układu Nerwowego (KOROUN) w Narodowym Instytucie Leków. Spośród 25 małopolskich szpitali potencjalnie hospitalizujących chorych z IChP, szczepy włączone do badania pochodziły jedynie z sześciu (z dwóch szpitali krakowskich: Uniwersyteckiego Szpitala Klinicznego CMUJ i Szpitala im. Jana Pawła II oraz z czterech szpitali powiatowych w Oświęcimiu, Tarnowie, Wadowicach i Brzesku).

Wstępną identyfikację szczepów S. pneumoniae przeprowadzono w lokalnych laboratoriach szpitali, w których przebywali chorzy z zakażeniami pneumokokowymi z woj. małopolskiego. Wyhodowane szczepy przesłano do KOROUN, gdzie pneumokoki identyfikowano metodami stosowanymi rutynowo. Oceniano morfologię kolonii na podłożu Columbia agar z dodatkiem 5% krwi baraniej oraz morfologię komórek w preparacie mikroskopowym, barwionym metodą Grama. Dla wszystkich szczepów oznaczano wrażliwość na optochinę oraz wykonywano test rozpuszczalności komórek w 2% roztworze dezoksycholanu sodu.

Serotypy S. pneumoniae określono z wykorzystaniem łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) i specyficznych starterów (10) w Zakładzie Epidemiologii i Mikrobiologii Klinicznej Narodowego Instytutu Leków lub w Statens Serum Institut (Kopenhaga, Dania) na podstawie testu opartego na reakcji pęcznienia otoczek (reakcja Quellunga) ze specyficznymi surowicami, zawierającymi przeciwciała przeciw antygenom otoczkowym S. pneumoniae.

Najmniejsze stężenia hamujące penicyliny oznaczano metodą mikrorozcieńczeń antybiotyku w bulionie zgodnie z zaleceniami CLSI (11) lub metodą z użyciem Etestów (AB Biodisk) wg instrukcji producenta.

WYNIKI

Retrospektywna analiza kliniczna i mikrobiologiczna potwierdzonych laboratoryjnie przypadków IChP w województwie małopolskim wykazała, że od stycznia 2000 do czerwca 2008 r. z terenu objętego badaniem do KOROUN nadesłano 28 inwazyjnych izolatów pneumokoków wyhodowanych od chorych między 1 miesiącem, a 14 rokiem życia. Siedemnaście z nich (60,7%) pochodziło od pacjentów poniżej 5 roku życia. Zakażenia najczęściej przebiegały w postaci neuroinfekcji, rzadziej w postaci krwiopochodnego zapalenia płuc i posocznicy. Wyniki analizy przedstawia tabela I.

Najczęstszymi serotypami określonymi w badaniu były: 14 (n=7), 19F (n=5), 6B (n=4) i 23F (n=3). Pozostałe serotypy (4, 15B, 1, 7F, 18C, 28F i 37) reprezentowane były przez 1 lub 2 izolaty. Pokrycie serotypowe 7vPCV dla całej grupy określono na 78,0%, a dla dzieci do 5 r.ż. na 94,0%.

W badanej grupie trzech pacjentów zmarło (CFR=10,7%), a zgony, wszystkie u dzieci poniżej 5 r.ż., spowodowane były zakażeniami szczepami o serotypach obecnych w szczepionce 7-walentnej: 19F, 23 F oraz 6B. Przyczyną zgonu były nieodwracalne zmiany w mózgu w przebiegu zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu. W sześciu przypadkach neuroinfekcji stwierdzono trwałe, poważne powikłania: wodogłowie wewnętrzne, opóźniony rozwój psycho-ruchowy, głuchotę, padaczkę, niedowłady i afazję. Wszystkie te przypadki były spowodowane szczepami o serotypach szczepionkowych (7vPCV): 4, 6B, 14 i 19F.

Dziewięć szczepów (32,1%) wykazało obniżoną wrażliwość na penicylinę. Osiem z nich, wyhodowanych od pacjentów z BZOMR, było opornych na penicylinę z wartościami najmniejszych stężeń hamujących (MIC) w zakresie od 0,19 do 4 mg/L. Jeden szczep z MIC penicyliny 3 mg/L, wyhodowany od pacjenta z sepsą, był średnio-wrażliwy na ten antybiotyk. Niewrażliwość na penicylinę wystąpiła u szczepów należących do następujących serotypów: 14 (n=3), 19F (n=3), 6B (n=2) i 23F (n=1). Wśród szczepów niewrażliwych na penicylinę 5 wykazywało oporność, a 2 średnią wrażliwość na cefalosporyny III generacji. W jednym przypadku BZOMR (przypadek nr 28, tabela I) wywołanym przez szczep oporny na penicylinę i cefotaksym o serotypie 14, u pacjentki wystąpiła ostra reakcja alergiczna po podaniu wankomycyny. Ostatecznie eradykację uzyskano po zastosowaniu rifampicyny, którą dołączono do cefalosporyny III generacji.

DYSKUSJA

W Polsce liczba przypadków inwazyjnej choroby pneumokokowej (IChP) wydaje się nadal znacznie niedoszacowana. Na rycinie 1 przedstawiono dane opublikowane przez PZH, które od 2005 roku zbiera meldunki o zachorowaniach na IChP. Stwierdza się wyraźny wzrost liczby zgłoszonych przypadków w roku 2007 i 2008 co najprawdopodobniej w dużej mierze zawdzięczamy wzmożonemu nadzorowi epidemiologicznemu nad Inwazyjną Chorobą Meningokokową (12, 13).

Dowodem na niską wykrywalność nawet najcięższych postaci IChP w Polsce są dane przedstawione na rycinie 2.

W 45% przypadków bakteryjnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych zgłoszonych do PZH w 2007 roku czynnik etiologiczny był nieznany (13). Z doświadczeń nielicznych ośrodków, które wykorzystują w praktyce również badania metodą PCR i mają znacznie lepszą wykrywalność czynników etiologicznych pozaszpitalnych BZOMR wiemy, że większość zachorowań w Polsce spowodowanych jest przez meningokoki i pneumokoki (dane KOROUN).

Niedoszacowanie liczby chorych na IChP ma podłoże zarówno organizacyjno-ekonomiczne, jak i psychologiczne. Wielu lekarzy nie pobiera posiewów krwi od gorączkujących dzieci. Wg danych zbieranych w ramach European Antibiotic Resistance Surveillance System (EARSS) częstość posiewów krwi wykonywanych w Polsce jest 3-4 razy niższa w porównaniu do krajów będących dłużej członkami Unii Europejskiej (14). Może to wynikać z niedocenienia skuteczności i wagi mikrobiologicznej diagnostyki zakażeń, jak również z faktu, że nie wszystkie szpitalne laboratoria bakteriologiczne przesyłają wyhodowane szczepy do potwierdzenia w KOROUN.

W badaniu dotyczącym zapadalności na IChP u dzieci do 5 r.ż. przeprowadzonym w 5 województwach Polski okazało się, że wynosi ona 17,6/100 000 w tej grupie wiekowej, ale jest nieco wyższa, 19/100 000, u dzieci do 2 r.ż. (14). Zróżnicowane zapadalności obserwuje się w wielu europejskich krajach, ale wydaje się, że niskie zapadalności są raczej wynikiem niedoszacowania i braku monitorowania tych zakażeń (15).

W niniejszym badaniu ponad 32% badanych szczepów wykazało obniżoną wrażliwość na penicylinę, z czego wszystkie, poza jednym, były oporne i odpowiadały za zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych, których w takiej sytuacji nie można leczyć penicyliną. Co więcej wśród tych szczepów ponad połowa wykazała również niewrażliwość na cefalosporyny III generacji. Wszystkie szczepy niewrażliwe na penicylinę należały do serotypów będących w spektrum działania szczepionki 7-walentnej. Odsetek szczepów niewrażliwych na penicylinę otrzymany w niniejszym badaniu jest ponad dwukrotnie wyższy od tych uzyskanych we wcześniejszych polskich badaniach (14,8%; 11,5%), dotyczących pneumokoków z zakażeń ośrodkowego układu nerwowego od pacjentów z terenu całej Polski (16, 17). Różnica ta, po pierwsze, może wynikać z faktu, że wcześniejsze badania dotyczyły pacjentów z wszystkich grup wiekowych, a przedstawiane badanie obejmuje jedynie przypadki dzieci poniżej 15 r.ż. Częstsze występowanie szczepów opornych na penicylinę wśród dzieci czy młodzieży obserwowano w uprzednim badaniu (16). Po drugie, nie można również wykluczyć, że wśród izolatów odpowiadających za zakażenia z zajęciem ośrodkowego układu nerwowego jest coraz więcej opornych na penicylinę.

Według rekomendacji CLSI z 2008 roku, zmieniła się interpretacja MIC penicyliny dla pneumokoków z zakażeń innych niż BZOMR. Obecnie, graniczne wartości MIC penicyliny dla izolatów wyhodowanych z zakażeń przebiegających bez zajęcia ośrodkowego układu nerwowego wynoszą: ≤2,0 mg/L dla izolatów wrażliwych, 4,0 mg/L dla izolatów średniowrażliwych, ≥8,0 mg/L dla izolatów opornych, przy podawaniu antybiotyku drogą pozajelitową (11).

Według wcześniejszych rekomendacji CLSI obowiązujących do 2007 roku dla izolatów S. pneumoniae graniczne wartości MIC penicyliny wynosiły: ≤0,06 mg/L dla izolatów wrażliwych, 0,12-1,0 mg/L dla izolatów średniowrażliwych i ≥2,0 mg/L dla izolatów opornych. Powyższe zalecenia opatrzono jednak komentarzem, że zakażenia inne niż zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych wywoływane przez szczepy średniowrażliwe można skutecznie leczyć wysokimi dawkami penicylin podawanych pozajelitowo (18). Właśnie ta praktyka kliniczna skłoniła do przekształceń rekomendacji. Jednak porównując odsetki występowania szczepów średniowrażliwych czy opornych na penicylinę wśród pneumokoków z lat wcześniejszych i obecnie, należy mieć tę zmianę na uwadze.

Analiza serologiczna badanych w tym opracowaniu szczepów inwazyjnych wykazała, że pneumokoki należące do czterech serotypów szczepionkowych: 14, 19F, 6B i 23F, odpowiadają razem za ponad 67% przypadków IChP, potwierdzonych hodowlą, u dzieci poniżej 15 r.ż. z terenu Małopolski. Pokrycie serotypowe 7vPCV dla całej grupy określono na 78,0%, a dla dzieci do 5 r.ż. na 94,0%. Należy podkreślić, że wszystkie przypadki powikłane oraz te zakończone zgonem pacjenta jak i te wywołane przez szczepy o obniżonej wrażliwości na penicylinę, spowodowane były przez szczepy należące do serotypów będących w spektrum działania skoniugowanej szczepionki 7-walentnej. Podobne obserwacje poczynili autorzy wspominanej powyżej polskiej pracy, gdzie wszystkie serotypy oporne oraz te odpowiedzialne za przypadki powikłane i śmiertelne były serotypami szczepionkowymi (14).

Podsumowując, wyniki niniejszej obserwacji potwierdzają korzyści powszechnego stosowania skoniugowanej szczepionki przeciwpneumokokowej w populacji polskich dzieci.

WNIOSKI

Za najcięższe przypadki IChP występujące w Małopolsce odpowiadały szczepy o serotypach zawartych w 7vPCV. Wyniki niniejszej obserwacji potwierdzają korzyści powszechnego stosowania skoniugowanej szczepionki przeciwpneumokokowej w populacji polskich dzieci.

Podziękowanie

Autorzy składają podziękowanie za bardzo wydatną pomoc w opracowaniu danych: dr. med. Jackowi Domańskiemu i mgr Annie Szkarłat z Uniwersyteckiego Szpitala Dziecięcego w Krakowie, mgr Grażynie Kwarciak z KSS im. JP II w Krakowie, dr Bożenie Ubik-Wróbel i mgr Annie Ochmańskiej Szpital SPZOZ Oświęcim, dr Grażynie Zawadzie i mgr Izabeli Trendocie ze Szpitala Specjalistycznego im. E. Szczeklika w Tarnowie, dr. Krzysztofowi Kasperczykowi i mgr Jolancie Dzigaj-Fiałkowskiej ze Szpitala Rejonowego w Brzesku oraz dr. Jerzemu Grybosiowi i mgr Marii Cieśli ze Szpitala Powiatowego im. Jana Pawła II w Wadowicach.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO:

1. Greenwood B.: A global action plan for the prevention and control of pneumonia. Bulletin of the World Health Organisation, 2008, 86, 408-416.

2. AlonsoDeVelasco E., Verheul A., Verhoef J., Snippe H.: Streptococcus pneumoniae: virulence factors, pathogenesis, and vaccines. Microbiol. Rev., 1995, 59, 591-603.

3. Johnston R.B. Jr.: Pathogenesis of pneumococcal pneumonia. Rev. Infect. Dis., 1991, 13 (Supl. 6), S509-517.

4. Cundell D., Masure H.R., Tuomanen E.I.: The molecular basis of pneumococcal infection: a hypothesis. Clin. Infect. Dis., 1995, 21 (Supl. 3), S204-212.

5. Musher D.M.: Streptococcus pneumoniae. W: G.L. Mandell, J.E. Bennett, R. Dolin (red.), Principles and practice of infectious diseases. Fifth edition. Churchill Livingstone 2000, New York, 2128-2147.

6. Roos K.L., Tunkel A.R., Scheld W.M.: Acute bacterial meningitis in children and adults. W: W.M. Scheld, R.J. Whitley, D.T. Durack (red.), Infections of the central nervous system. Lippincott – Raven Publishers 1997, Philadelphia, 335-401.

7. Henrichsen J.: Six newly recognised types of Streptococcus pneumoniae. J. Clin. Microbiol., 1995, 32, 2759-2762.

8. Kaufmann F., Lund E., Eddy B.E.: Proposal for a change in the nomenclature of Diplococcus pneumoniae and a comparison of the Danish and American type designations. Int. Bull Bacteriol. Taxon, 1960, 10, 31-40.

9. Fine M.J., Smith M.A., Carson C.A., Meffe F., Sankey S.S., Weissfeld L.A., Detsky A.S., Kapoor W.N.: Efficacy of pneumococcal vaccination in adults: a meta-analysis of randomized controlled trials. Arch. Intern. Med., 1994, 154, 2666-2677.

10. Pai R., Gertz R.E., Beall B.: Sequential multiplex PCR approach for determining capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae isolates. J. Clin. Microbiol., 2006, 44, 124-131.

11. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; eighteenth informational supplement. CLSI document 2008; M100-S18. CLSI, Wayne, PA.

12. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny, Zakład Epidemiologii, Główny Inspektorat Sanitarny – Departament Przeciwepidemiczny, Meldunki o zachorowaniach na choroby zakaźne i zatruciach w Polsce w 2008 roku. www. pzh.gov.pl/oldpage/epimeld/index_p.html

13. Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny, Zakład Epidemiologii, Główny Inspektorat Sanitarny – Departament Przeciwepidemiczny, Choroby zakaźne i zatrucia w Polsce w 2007 roku. www. pzh.gov.pl/oldpage/epimeld/index_p.html

14. Grzesiowski P., Skoczynska A., Albrecht P., Konior R., Patrzalek M., Sadowska M., Staroszczyk J., Szenborn L., Wysocki J., Hryniewicz W.,  Polish Pediatric IPD Group: Invasive pneumococcal disease in children up to 5 years of age in Poland. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis,. 2008, 27, 883-885.

15. Pebody R.G., Hellenbrand W., D’Ancona F., Ruutu P.: European Union funded Pnc-EURO contributing group: Pneumococcal disease surveillance in Europe. Euro. Surveill., 2006, 11, 171-178.

16. Skoczyńska A., Hryniewicz W.: Genetic relatedness, antibiotic susceptibility and serotype distribution of Streptococcus pneumoniae responsible for meningitis in Poland, 1997-2001. Microb. Drug Resist., 2003, 9, 175-182.

17. Sadowy E., Skoczyńska A., Fiett J., Gniadkowski M., Hryniewicz W.: Multilocus sequence types, serotypes and variants of the surface antigen PspA in Streptococcus pneumoniae isolates from meningitis in Poland. Clin. Vaccine Immunol., 2006, 13, 139-144.

18. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; fifteenth informational supplement. CLSI document 2005; M100-S15. CLSI, Wayne, PA.

..............................................................................................................................................................

Adres do korespondencji:

Ryszard Konior
Oddział Neuroinfekcji i Neurologii Dziecięcej
Krakowski Szpital Specjalistyczny im. Jana Pawła II
ul. Prądnicka 80, 31-202 Kraków
tel. (0-12) 614-20-31
rkonior@szpitaljp2.krakow.pl